慢性心力衰竭患者血清微小RNA-29b和血小板源性生长因子水平与病情严重程度、心室重构的相关性▲

王盛尧 陈 宇 谭顺林

(四川省资阳市第一人民医院心血管内科，资阳市 641300，电子邮箱：wqp296@163.com)

慢性心力衰竭(chronic heart failure，CHF)是心肌梗死、心肌肥厚、心肌纤维化等心脏病变发展的终末阶段，其致残率、致死率均较高，且花费高、预后差，是目前全球严重的公共卫生问题之一[1-2]。心室重构是CHF发生和发展的主要病理基础。心室出现心肌损伤或负荷增加，可引起基因调控的分子、细胞和心肌间质发生变化，导致心肌收缩功能障碍和心室肥厚失代偿，进而引起心室重构，是影响CHF发病率和病死率的重要因素[3]。因此，寻找有效生物学指标早期评估及诊断CHF，并采取针对性措施进行干预，对改善患者病情、提高预后有重要意义。

微小RNA(microRNA，miRNA)具有作为心血管疾病生物标志物的潜在作用。Liu等[4]发现，急性心肌梗死模型大鼠血清中的miRNA-29b水平低于正常大鼠，miRNA-29b可能通过激活Notch信号通路抑制心肌纤维化和心肌肥大。血小板源性生长因子(platelet-derived growth factor，PDGF)是一类结缔组织细胞和神经胶质细胞的促有丝分裂原和化学催化剂，可以刺激细胞分裂、增殖，参与多种血管性疾病的发生和发展[5]。研究表明，急性心肌梗死患者血清PDGF水平较健康人升高[6]。基于miRNA-29b和PDGF在心肌疾病中均呈异常表达，本文分析CHF患者血清中miRNA-29b和PDGF的表达情况，探讨二者与病情严重程度、心室重构的相关性，以期为相关的临床研究及指标检测提供参考。

1 资料与方法

1.1 临床资料 纳入2017年3月至2019年3月在本院心内科住院治疗的148例CHF患者作为CHF组。纳入标准：(1)符合中华医学会心血管病学分会制定的《中国心力衰竭诊断和治疗指南2014》[7]中CHF的诊断标准；(2)临床资料完整；(3)自愿参与研究且中途无退出者；(4)患者家属知情同意。排除标准：(1)近1个月内行血管重建术者；(2)近3个月内有急性心肌梗死、严重肝肾功能不全者；(3)近3个月内有不稳定型心绞痛者；(4)严重感染者及自身免疫性疾病患者；(5)恶性肿瘤患者；(6)近3个月内使用过可能影响PDGF等检测指标的药物或制剂者。148例CHF患者中男性82例、女性66例，年龄40～74(57.18±8.22)岁；根据美国纽约心脏病协会(New York Heart Association，NYHA)心功能分级标准[8]对CHF患者进行分级，其中Ⅰ～Ⅱ 级47例(Ⅰ～Ⅱ级亚组)、Ⅲ级52例(Ⅲ级亚组)、Ⅳ级49例(Ⅳ级亚组)；发生心室重构44例(心室重构亚组)，未发生心室重构104例(非心室重构亚组)病程1～9(4.98±1.60)年；原发疾病：冠心病64例，高血压心脏病57例，心脏瓣膜病27例。另选取同期在本院体检的150例健康者作为对照组，心脏功能均正常，无吸烟、饮酒史。其中男性81例、女性69例，年龄43～70(56.36±6.51)岁。本研究符合《赫尔辛基宣言》，经本院医学伦理委员会批准后实施，所有患者及其家属均签署知情同意书。

1.2 临床资料收集 收集研究对象的性别、年龄、体质指数、基础疾病情况等一般资料。

1.3 血清指标的检测

1.3.1 主要试剂与仪器：TRIzol试剂(货号：MN562J2)、反转录试剂盒(货号：J6547M)、荧光定量PCR试剂盒(货号：N5643MJ)购自美国Sigma公司；miRNA-29b及内参U6引物由上海生工生物工程有限公司合成；PDGF酶联免疫吸附检测试剂盒(货号：SEA480Hu-1)购自上海岚派生物科技有限公司。荧光定量PCR分析仪(型号：YFGB1022)购自日本Olympus公司。

1.3.2 血清样本的采集与保存：抽取所有研究对象(CHF组于入院次日清晨、对照组于健康体检时)的空腹肘静脉血5 mL，注入无菌离心管中混匀，室温条件下以4 000 r/min离心10 min，取上清液，于-80℃冰箱中保存备用。

1.3.3 酶联免疫吸附法检测血清PDGF水平：从-80℃冰箱中取出冻存血清，解冻后采用酶联免疫吸附法测定受试者血清中的PDGF水平。所有操作均严格按照试剂盒说明书进行。

1.3.4 实时荧光定量PCR法测定血清miRNA-29b表达水平：从-80℃冰箱中取出血清样本，按照TRIzol试剂盒说明书提取总RNA，参照反转录试剂盒说明书将RNA反转录为cDNA。参照实时荧光定量PCR试剂盒说明书进行实时荧光定量PCR反应，所用引物序列见表1。反应体系为20 μL，包括SYBR Premix I Ex TaqTM10 μL、cDNA 1 μL、H2O 8 μL、上下游引物各0.5 μL。反应程序为95℃预处理20 s，95℃ 10 s，60℃ 20 s，72℃ 10 s，共40个循环。以U6作为内参基因，采用2-ΔΔCt法计算血清miRNA-29b的相对表达水平。

表1 引物序列

1.3.5 基于生物信息学分析miRNA-29b与PDGF关系：基于生物信息学网站miRanda(http://www.microrna.org/microrna/home.do)预测miRNA-29b和PDGF的结合位点。

1.4 超声心动图检查 由本院超声科专职医师使用美国HP5500型彩色多普勒超声心动仪诊断系统，对所有研究对象进行心脏彩色超声检查，测定左心功能。嘱患者左侧卧位，取胸骨旁左心室长轴切面，测定并记录左心室射血分数(left ventricular ejection fraction，LVEF)、左心室舒张末期容积(left ventricular end-diastolic volume，LVEDV)、左心室舒张末期室间隔厚度、左心室后壁厚度、左心室舒张末期内径。根据Devereux等[9]提出的公式计算左心室质量指数(left ventricular mass index，LVMI)，LVMI=左心室重量/体表面积，其中左心室重量=1.04×[(左心室舒张末期室间隔厚度+左心室后壁厚度+左心室舒张末期内径)3-左心室舒张末期内径3]-13.6，体表面积=0.006×身长(cm)+0.013×体重(kg)-0.153。所有参数均测量5个心动周期，取平均值。计算LVEDV增长率，即△LVEDV%=(LVEDV1-LVEDV0)/LVEDV0×100%，其中LVEDV0为CHF患者发病后4 d的LVEDV，LVEDV1为随访6个月时的LVEDV；将△LVEDV%≥20%定义为心室重构[10]。

1.5 统计学分析 采用SPSS 17.0软件进行统计分析。符合正态分布的计量资料以(x±s)表示，方差齐时两组间比较采用两独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD-t检验；方差不齐时，两组间比较采用Mann-Whitneyu检验，多组间比较则采用Kruskal-WallisH检验。计数资料以例数(百分比)表示，组间比较采用χ2检验；采用Pearson检验进行相关性分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 4组一般资料的比较 4组的性别、年龄、合并糖尿病情况、合并高血压情况、体质指数比较，差异均无统计学意义(均P>0.05)。见表1。

表1 4组一般资料的比较

2.2 不同心功能亚组CHF患者血清miRNA-29b和PDGF水平的比较 与对照组比较，各心功能亚组CHF患者血清miRNA-29b相对表达水平均降低，血清PDGF水平均增高(P<0.05)；Ⅰ～Ⅱ级亚组、Ⅲ级亚组、Ⅳ级亚组CHF患者的血清miRNA-29b相对表达水平依次降低，血清PDGF水平依次升高(均P<0.05)。见表2。

表2 不同心功能亚组CHF患者血清miRNA-29b相对表达水平和PDGF水平与对照组的比较(x±s)

2.3 心室重构亚组和非心室重构亚组CFH患者血清miRNA-29b相对表达水平和PDGF水平的比较 与非心室重构亚组比较，心室重构亚组CHF患者血清miRNA-29b相对表达水平降低，血清PDGF水平升高(均P<0.05)。见表3。

表3 心室重构亚组与非心室重构亚组CFH患者血清miRNA-29b相对表达水平和PDGF水平的比较(x±s)

2.4 4组超声心动图左心室重构指标的比较 与对照组比较，各亚组CHF患者的LVMI、LVEDV水平均升高，LVEF水平均降低(均P<0.05)；Ⅰ～Ⅱ级亚组、Ⅲ级亚组、Ⅳ级亚组CHF患者的LVMI、LVEDV水平依次升高，LVEF水平依次降低(均P<0.05)；Ⅲ级亚组、Ⅳ级亚组CHF患者的心室重构率高于Ⅰ～Ⅱ级组患者(均P<0.05)。见表4。

表4 不同心功能亚组CHF患者超声心动图心室重构指标与对照组的比较

2.5 CHF患者血清miRNA-29b相对表达水平和PDGF水平的相关性 生物信息学预测结果显示，miRNA-29b和PDGF存在结合位点，见图1。Pearson相关性分析结果显示，CHF患者血清miRNA-29b相对表达水平与血清PDGF水平呈负相关(r=-0.601，P<0.001)。

图1 生物信息学预测结果

2.6 CFH患者血清miRNA-29b相对表达水平和PDGF水平与左心室重构指标的相关性 在CHF患者中，血清miRNA-29b表达水平与LVMI、LVEDV呈负相关(r=-0.538，P<0.001；r=-0.512，P<0.001)，与LVEF呈正相关(r=0.496，P<0.001)；血清PDGF水平与LVMI、LVEDV呈正相关(r=0.520，P<0.001；r=0.529，P<0.001)，与LVEF呈负相关(r=-0.467，P<0.001)。

3 讨 论

CHF是由于心脏收缩功能及舒张功能发生障碍，不能将静脉回心血充分排出心脏，导致静脉系统血液淤积、动脉血液灌注不足而引起心肌结构异常和心功能不全的一种临床综合征，其是心血管疾病发展的终末阶段[11]。左心室重构是心血管事件中重要的靶器官损害及并发症，是心脏对慢性容量和压力超负荷的适应性改变，可使心肌细胞肥大、纤维化，心肌代谢及电生理发生改变，导致左心室容积增大，最终导致CHF[12]。因此，探寻有效生物学指标用于评估左心室重构从而及时采取相应措施进行干预，对预防及治疗CHF有重要意义。

miRNA为单链RNA分子，参与调控基因表达、细胞增殖、分化、凋亡等生物学过程[13]。越来越多研究表明miRNA在心血管疾病中发挥作用[14]。如刘志立等[15]研究报道，血清miRNA-29b表达水平降低与急性心肌梗死的发生有关，且可作为预测患者死亡的指标之一；Zhu等[16]发现，小檗碱可以通过诱导miRNA-29b表达上调来促进血管生成，进一步缩小小鼠心肌梗死面积，从而改善心脏功能；Wang等[17]发现，肾交感神经去神经支配可能通过上调miRNA-29b的表达来减轻异丙肾上腺素诱导的左心室重构。本研究结果显示，各亚组CHF患者的血清miRNA-29b相对表达水平低于对照组，且随着心功能分级的增加而逐渐降低(均P<0.05)。这提示miRNA-29b异常低表达可能不仅与CHF的发生有关，同时也与病情严重程度关系密切。

PDGF是成纤维细胞、平滑肌细胞以及其他间充质来源细胞的强有丝分裂原和化学驱动剂，也是心血管系统的重要调节因子[18]。任良强等[19]发现，不稳定型心绞痛患者治疗后PDGF水平显著低于治疗前，且随着NYHA心功能分级下降而逐渐降低。初志辉等[20]研究报道，稳定型心绞痛患者血清PDGF水平明显高于健康人群，且血清PDGF水平与患者冠状动脉病变程度有一定关联。本研究结果显示，各亚组CHF患者血清PDGF水平高于对照组，且随着心功能分级的增加而逐渐升高(均P<0.05)，与上述研究结果相似。这提示PDGF水平异常高表达与CHF发生有关，同时也与病情严重程度关系密切。我们进一步行生物信息学预测，结果提示miRNA-29b与PDGF的3′端非编码区存在结合位点，且相关性分析结果显示，CHF患者血清miRNA-29b相对表达水平与PDGF水平呈负相关(P<0.05)，提示miRNA-29b可能通过负调控PDGF影响CHF的发生和发展。

LVMI、LVEF、LVEDV是评价心室重构的敏感性指标，其中LVMI通过患者的左心室质量及体表面积评估心脏生理情况[21]。Huang等[22]发现，与健康人群比较，原发性高血压患者血清miRNA-29b相对表达水平与LVMI呈正相关，提示miRNA-29b或可反映原发性高血压患者的靶器官损害情况。本研究中，对照组、Ⅰ～Ⅱ级组、Ⅲ级组、Ⅳ级组的LVMI和LVEDV依次升高，LVEF依次降低，且Ⅲ级组、Ⅳ级组CHF患者的心室重构率明显高于Ⅰ～Ⅱ 级组患者，CHF患者血清miRNA-29b相对表达水平与LVMI、LVEDV呈负相关，而与LVEF呈正相关，血清PDGF水平与LVMI、LVEDV呈正相关，而与LVEF呈负相关，同时发现心室重构亚组CHF患者血清miRNA-29b相对表达水平明显低于非心室重构亚组，血清PDGF水平明显高于非心室重构亚组(均P<0.05)。以上结果表明CHF患者血清miRNA-29b相对表达水平降低、PDGF水平升高可能与心室重构有关。

综上所述，CHF患者血清miRNA-29b表达下调，而PDGF水平升高，两者与病情严重程度及心室重构关系密切，miRNA-29b可能通过靶向调控PDGF参与CHF的发生和发展。然而本研究样本量较少，后期应加大样本量进一步对miRNA-29b、PDGF在CHF及心室重构中的具体作用机制进行探讨。