大米低聚肽的制备和结构表征及体外抗氧化作用

刘文颖 冯晓文 程青丽 王卓然 谷瑞增

(1.中国农业大学 工学院，北京 100083；2.中国食品发酵工业研究院有限公司 北京市蛋白功能肽工程技术研究中心，北京 100015；3.北京农学院 食品科学与工程学院，北京 102206)

我国约有60%的人口以大米为主要粮食，其中2021年1月至4月我国累计进口大米192万吨，同比增加155.2%，创我国阶段性大米进口的历史纪录[1- 2]。大米蛋白主要是大米淀粉生产的副产物，也可从米糠和碎米中直接提取[3]。大米蛋白营养丰富，含人体必需的各种氨基酸，其氨基酸组成平衡、合理，接近“完全蛋白”，生物价高达77%，与虾仁、牛肉等相似[4]。此外，与其他谷物蛋白质相比，大米蛋白还具有低过敏性、不含抗营养因子、消化率高、无色素干扰及味道柔和等特点[3- 4]。近年来，从动植物蛋白质中获取生物活性肽成为食品科学研究领域的一个热点。通过采用温和的酶法水解大米蛋白制备大米肽，可以提高大米蛋白附加值，实现对大米蛋白的精深加工与利用，并且有效改善其功能属性，更易消化吸收[5- 6]。

人体过多的自由基会造成机体功能紊乱，导致多种疾病，如心血管疾病、癌症、神经退行性疾病、动脉硬化等。人工合成抗氧化剂如BHA(丁基羟基茴香醚)、BHT(2，6- 二叔丁基- 4- 甲基苯酚)、TBHQ(叔丁基对苯二酚)等虽然具有很强的抗氧化活性，但长期服用会对机体产生毒副作用。作为天然安全的生物抗氧化剂，抗氧化活性肽能够减少自由基，抑制或消除氧化反应，降低自动氧化速率和脂肪的过氧化物含量，保护细胞抵御自由基介导的氧化应激损伤，从而达到抗衰老的功能[7]。与化学抗氧化剂相比，动植物来源的抗氧化活性肽安全性高、无毒副作用，作为天然抗氧化剂在食品和医药行业中具有强大的竞争力，是研究人员探索最多的一种生物活性肽。目前已报道了乌鸡、鸡蛋、牛奶、大豆等多种蛋白来源活性肽的抗氧化作用，并且有研究表明抗氧化肽的活性与其结构有关[7- 9]。目前，关于大米低聚肽结构和抗氧化活性的系统、全面研究还鲜见报道。

本研究以大米蛋白粉为原料，经生物酶解、分离纯化等步骤制得大米低聚肽，在对其基础理化成分分析的基础上，利用相对分子质量分布、氨基酸组成、扫描电镜、紫外光谱和圆二色光谱分析进行结构表征，然后通过羟基自由基清除能力、铁离子还原能力(FRAP)、氧自由基吸收能力(ORAC)和还原能力4种不同的体外抗氧化评价体系考察其体外抗氧化作用，旨在为大米低聚肽功能性产品的开发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

大米蛋白粉，北京中食海氏生物技术有限公司提供；碱性蛋白酶(≥400 000 DU/g)、中性蛋白酶(≥1 600 AU/g)，购自杜邦丹尼斯克公司；FRAP测定试剂盒，购自碧云天生物技术研究所；分子质量标准品、偶氮二异丁脒盐酸盐(AAPH)、Fluorescein(荧光指示剂)、Trolox(水溶性维生素E)，均购自美国Sigma公司；其他分析纯试剂，购自北京化工厂。

UV- 1780紫外可见分光光度计，日本SHIMADZU公司生产；Spectra MR多功能酶标仪，美国DYNEX公司生产；LC- 20A高效液相色谱仪，日本SHIMADZU公司生产；SpectraMax i3x多功能酶标仪，美国MD公司生产；A300全自动氨基酸分析仪，德国曼默博尔公司生产；QSY- Ⅱ型凯式定氮仪，北京强盛分析仪器制造中心生产；HH- 501型超级恒温水浴锅，常州国宇仪器制造有限公司生产；DHG- 9075A电热恒温鼓风干燥箱，北京陆希科技有限公司生产；LG10- 2.4A型高速离心机，北京医用离心机厂生产。

1.2 实验方法

1.2.1 大米低聚肽的制备

称取500 g大米蛋白粉，溶解于蒸馏水中，然后置于50 ℃水浴锅中，调节pH值至8.5，之后加入碱性蛋白酶4.0 g，酶解2 h后，调节水解液pH值为6.0，然后加入中性蛋白酶4.2 g，继续酶解2 h。期间用0.1 mol/L的HCl或NaOH调节水解液，使pH值保持不变。酶解结束后在100 ℃沸水浴条件下灭酶，冷却至室温后，6 000g离心10 min，取上清液，用孔径为200 nm的陶瓷膜过滤，取滤过清液，然后用截留相对分子质量为1 000的超滤膜超滤，得到相对分子质量小于1 000的滤过液，之后将溶液浓缩并冷冻干燥，得到大米低聚肽粉[10]。

1.2.2 基础理化成分测定

参照相关国标方法，即按GB 5009.5—2016《食品中蛋白质的测定》中的方法测定蛋白质含量，按GB/T 22729—2008《海洋鱼低聚肽粉》中的方法测定酸溶蛋白含量，按GB 5009.6—2016《食品中脂肪的测定》中的方法测定脂肪含量，按GB 5009.3—2016《食品中水分的测定》中的方法测定水分含量，按GB 5009.4—2016《食品中灰分的测定》中的方法测定灰分含量。

1.2.3 大米低聚肽的结构表征

1.2.3.1 氨基酸组成测定

按照GB 5009.124—2016《食品中氨基酸的测定》中的方法，采用全自动氨基酸分析仪对大米低聚肽的水解氨基酸和游离氨基酸组成进行分析。测定大米低聚肽的水解氨基酸含量时，大米低聚肽的水解方法为：称取0.1 g大米低聚肽样品于水解管中，加入10 mL 6 mol/L盐酸溶液和3滴苯酚，然后充氮气3 min，封口；放在110 ℃的电热鼓风恒温箱内，水解22 h后取出，冷却至室温。打开水解管，将水解液过滤至50 mL容量瓶内，用水定容至相应刻度，振荡混匀。准确吸取0.2 mL滤液，使用氮吹仪吹干，加入1 mL稀释液复溶，振荡混匀后，吸取溶液通过0.22 μm滤膜后，转移至仪器进样瓶，供测定使用。

1.2.3.2 相对分子质量分布的测定

利用流动相配制质量浓度为1 g/L的样品溶液，经孔径0.2 μm聚四氟乙烯过滤膜过滤后，用高效液相色谱仪进行凝胶过滤，通过紫外检测器进行检测，使用GPC软件处理色谱数据。同时配制质量分数为0.1%肽标准品溶液，过膜后进样，制作相对分子质量校正曲线。4种肽标准品为：乙氨酸- 乙氨酸- 乙氨酸(相对分子质量为189)、乙氨酸- 乙氨酸- 酪氨酸- 精氨酸(相对分子质量为451)、杆菌酶(相对分子质量为1 450)、细胞色素C(相对分子质量为12 500)。色谱条件为：色谱柱，TSKgel G2000 SWXL型，300 mm×7.8 mm；流动相，体积比V(乙腈)：V(水)：V(三氟乙酸)为45：55：0.1；流速，0.5 mL/min；进样体积，10 μL；检测波长，220 nm；柱温，30 ℃[11]。

1.2.3.3 扫描电镜分析

将大米低聚肽干粉样品涂抹在样盘双面胶上，然后进行氮吹处理。处理好的样品放入扫描电镜中抽真空，施加一定的电压，调整束斑尺寸，待聚焦清晰后分别在500倍和1 000倍下获取图像，观察它们的区别[12]。

1.2.3.4 紫外光谱扫描

将大米低聚肽配制成2.0 g/L的溶液，利用紫外可见分光光度计进行紫外光谱扫描，扫描波长为245～330 nm[11]。

1.2.3.5 圆二色光谱扫描

称取大米低聚肽于超纯水中，配制成1.0 g/L的溶液，进行圆二色光谱扫描。步长为0.2 nm，带宽为2.0 nm，光谱范围为190～250 nm，扫描速度为200 nm/min。从每个光谱中减去缓冲液的基线光谱，并使用Jasco软件内置的分析函数将得到的值转换为摩尔椭圆率(θ)[12]。

1.2.4 大米低聚肽的体外抗氧化活性测定

1.2.4.1 羟基自由基清除能力测定

采用水杨酸法[13]，依次加入100 μL不同质量浓度的样品溶液、200 μL 5 mmol/L水杨酸乙醇溶液、200 μL 5 mmol/L FeSO4溶液，实验组(吸光值为AX)以100 μL 5 mmol/L H2O2启动反应；对照组(吸光值为A0)以等体积蒸馏水启动反应；空白对照组(吸光值为A1)以等体积蒸馏水代替样品。涡旋振荡，37 ℃反应1 h后取200 μL反应液于96孔板中，在510 nm处测定吸光值。羟基自由基清除率(η，%)的计算如下：

(1)

将7.5 mL TPTZ(三吡啶基三嗪)稀释液和750 μL TPTZ溶液充分混匀后加入750 μL检测缓冲液，配制成FRAP工作液，于37 ℃孵育备用。在96孔板的检测孔中加入180 μL FRAP工作液，空白对照孔中加入5 μL蒸馏水，标准曲线检测孔内加入5 μL各种浓度(0.15、0.3、0.6、0.9、1.2和1.5 mmol/L)的FeSO4标准溶液，样品检测孔内加入5 μL样品溶液，轻轻混匀。37 ℃孵育5 min后于593 nm处测定吸光值，结果表示为mmol/L(以FeSO4为标准品计)[14]。

1.2.4.3 ORAC值测定

将25 μL样品溶液和100 μL的Fluorescein(0.8 μmol/L)于96孔板中混合，然后加入75 μL 150 mmol/L偶氮类化合物AAPH启动反应，此为实验组。分别用25 μL Trolox标准品(6.25、12.5、25、50、100、250、500 μmol/L)代替样品作为阳性对照(制作标准曲线)、25 μL磷酸缓冲液(pH=7.4，75 mmol/L)代替样品为空白对照，于37 ℃保温20 min，荧光酶标仪激发波长为485 nm，发射波长为530 nm，每隔5 min测定一次，测定总时间为120 min；另外做不加AAPH的对照。根据样品的荧光衰退曲线的保护面积和标准品的荧光衰退曲线的保护面积之比计算样品的ORAC值，结果表示为μmol/g(以Trolox为标准品计)[15]。

1.2.4.4 还原能力测定

反应体系为100 μL样品溶液、100 μL 0.2 mol/L磷酸盐缓冲溶液(pH=6.6)和100 μL质量分数1%的铁氰化钾，50 ℃水浴中保温20 min后，加入100 μL质量分数10%的三氯乙酸。取100 μL反应液，加入100 μL蒸馏水和20 μL质量分数0.1%的FeCl3溶液，放置10 min后，于700 nm下测定吸光值[16]。

1.2.5 数据处理

每组数据平行测定3次，实验结果用平均值±标准偏差表示，使用Origin 8.5软件作图。

2 结果与分析

2.1 大米低聚肽的基础理化成分

大米低聚肽中总蛋白质含量为95.75%±1.72%，脂肪含量为0.20%±0.02%，灰分含量为2.46%±0.13%，水分含量为5.17%±0.15%。酸溶蛋白质含量为92.27%±1.08%，占总蛋白质的96.39%±2.03%，游离氨基酸含量为3.16%±0.20%，经计算，低聚肽含量为89.11%±0.94%。由此可见，大米低聚肽蛋白质含量较高，其他成分含量很低，是一种优质蛋白质产物。

第二天晚上，见到爸爸进入洗澡间后，皮皮在门外耐心等待，见爸爸一直不开门，又开始哭闹，皮皮妈力挺女儿，皮皮爸终于打开了门。女儿一看，大哭：“呜……我不要你穿游泳裤洗澡，脱掉脱掉！呜……”皮皮爸低头，一言不发，满脸通红，憋了足足1分钟后脱下游泳裤。女儿仔细观察爸爸私处，然后用手摸摸，说道：“哦，原来是这样的啊，早给我看不就完了嘛。”说完满意地离开，从此不再骚扰爸爸洗澡了。

2.2 大米低聚肽的结构表征

2.2.1 大米低聚肽的氨基酸组成

大米低聚肽的氨基酸组成(以100 g大米低聚肽为基准)如表1所示。大米低聚肽中谷氨酸、天门冬氨酸和精氨酸含量较高，总含量为33.00 g，而色氨酸、胱氨酸和蛋氨酸含量较低，总含量仅为3.23 g。大米低聚肽含有8种必需氨基酸，总含量为24.98 g，占氨基酸总和的30.56%。第一限制性氨基酸赖氨酸含量为3.31 g，较为丰富，具有较高的营养价值。

表1 大米低聚肽的氨基酸组成

1)以100 g大米低聚肽为基准。

大米低聚肽的抗氧化活性与其氨基酸组成特点有一定的相关性。研究表明，许多氨基酸及其衍生物具有抗氧化能力，如组氨酸、赖氨酸、精氨酸、亮氨酸、酪氨酸、缬氨酸、色氨酸、丙氨酸等[17]。芳香族氨基酸酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸可作为抗氧化肽的活性位点，通过提供氢原子，使自由基链式反应减慢或终止[18]。大米低聚肽富含抗氧化性氨基酸，其中亮氨酸、丙氨酸、缬氨酸、酪氨酸含量较高。疏水性氨基酸占氨基酸总和的33.24%，碱性氨基酸占16.10%，酸性氨基酸占31.01%，有报道证明，疏水性氨基酸及其残基含量较多的肽呈现出较强的抗氧化作用[19- 20]。李佳南等[10]的研究表明，大米肽具有明显的自由基淬灭能力和抑制亚油酸自然氧化的作用，氨基酸序列测定结果表明，其抗氧化作用与其氨基酸组成有关。

2.2.2 大米低聚肽的相对分子质量分布

由图1可知，相对分子质量标准曲线方程为：lgMW=-0.212 630 9t+6.889 731，R2=0.996 566 9，其中MW为重均相对分子质量，t为洗脱时间。相对分子质量分布凝胶色谱图见图2，经计算得到大米低聚肽的相对分子质量分布，如表2所示。大米低聚肽为小分子肽段混合物，相对分子质量分布主要集中在1 000以下，其占比高达91.84%。其中，相对分子质量在150～1 000的小肽占85.66%，而1 000～2 000、2 000～3 000、3 000～5 000、>5 000的多肽占比分别为7.06%、0.91%、0.18%、0.01%，说明大米低聚肽的主要成分为1 000以下的小肽。研究表明，肽的抗氧化活性与相对分子质量大小有关。Dong等[21]使用截留相对分子质量 5 000、3 000、1 000的超滤膜将牡蛎肽分离纯化为不同组分，并考察了其抗氧化活性，结果表明相对分子质量小于1 000的肽组分表现出最强的抗氧化活性。这与其他研究人员的研究结果一致，即低分子肽具有更强的抗氧化活性[22- 23]。本试验中，大米低聚肽相对分子质量小于 1 000 的小肽占90%以上，同时小肽还能产生离子化的氨基和羧基，可提供电子或氢原子抑制氧化反应，从而终止自由基链式反应[24]。

表2 大米低聚肽的相对分子质量分布

图1 相对分子质量标准曲线

图2 大米低聚肽相对分子质量分布凝胶色谱图Fig.2 Gel filter chromatogram of relative molecular weight distribution of rice oligopeptides

2.2.3 扫描电镜结果与分析

大米低聚肽的扫描电镜图见图3。由图可以看出，在500倍和1 000倍放大倍数下，大米低聚肽为明显的球体颗粒状，表面有不规则的褶皱和小的

(a)放大500倍

气孔，这可能是由于酶解过程使蛋白质结构被破坏，从而使粒径变小，表面暴露出了更多的疏水性基团[25]。

2.2.4 紫外光谱分析

图4 大米低聚肽的紫外光谱图

2.2.5 圆二色光谱分析

利用圆二色光谱检测大米低聚肽的二级结构，谱图上的峰位和峰形显示，大米低聚肽的二级结构以多种构象并存(见图5)，大米低聚肽在198 nm的远紫外区有负吸收，二级结构主要为β- 折叠。利用CDNN软件分析得到大米低聚肽各二级结构的含量：α- 螺旋含量为6.0%±0.3%，平行式β- 折叠的为3.3%±0.2%，反平行式β- 折叠的为40.2%±1.9%，β- 转角的为19.5%±1.0%，无规则卷曲的为32.1%±2.5%。与蛋白质相比，肽的结构较为简单，主要具有肽链一级结构和二级结构[27]。大米低聚肽中紧密且没有空腔的稳定结构即α- 螺旋结构含量较少，β- 折叠及无规则卷曲含量较多，导致蛋白质分子表面疏水性变大[28]。这可能是由于酶解使蛋白质结构发生改变，蛋白质的空间结构展开，蛋白质分子内无序结构含量相对较高，β- 折叠和无规则卷曲增加，使得隐藏在内部的疏水性位点更多地显露出来，从而发挥特定的功能作用[29]，这可能也是大米低聚肽表现出一定抗氧化能力的原因所在。

图5 大米低聚肽的圆二色光谱图

2.3 大米低聚肽的体外抗氧化作用

2.3.1 大米低聚肽的羟基自由基清除能力

大米低聚肽和阳性对照Vc的羟基自由基清除能力如图6所示。在质量浓度0～25 g/L范围内，大米低聚肽对羟基自由基清除率随质量浓度的增加而增加，在质量浓度为25 g/L时，清除率为83.35%±2.53%，可见其对羟基自由基有很强的清除作用，半抑制浓度(IC50值)约为11.1 g/L。这表明大米蛋白被酶解成低聚肽后，能够暴露更多的活性基团或位点，作为供氢体还原自由基，从而终止自由基连锁反应，呈现出抗氧化能力[21]。Vc对羟基自由基的清除率先迅速增加，然后趋于平缓，IC50值约为0.07 g/L。大米低聚肽的羟基自由基清除能力弱于强抗氧化剂Vc，但是作为一种天然的功能活性物质，其安全性高，且无潜在毒副作用。赵佳佳[30]考察了大米肽的抗氧化能力，结果表明，大米肽的羟基自由基清除能力也与质量浓度呈量效关系，其IC50值为12.01 g/L，稍弱于本研究中大米低聚肽的清除能力。

(a)大米低聚肽

2.3.2 大米低聚肽的铁离子还原能力

利用FeSO4标准品绘制标准曲线，如图7所示。大米低聚肽和Vc的FRAP值见图8。在质量浓度10～30 g/L范围内，大米低聚肽的FRAP值与其质量浓度呈明显的正比关系，FRAP值随质量浓度的增加而增加。这表明大米低聚肽能够通过氢原子转移阻断自由基链式反应过程而实现抗氧化作用[31]。Vc在较低的质量浓度(0.015～0.08 g/L)下就能展示出较强的铁离子还原能力。虽然大米低聚肽的FRAP值明显低于Vc在各质量浓度下的FRAP值(P<0.05)，但与其他抗氧化肽的FRAP值相近[14]。张文敏等[32]以亚麻籽粕为原料，通过不同蛋白酶酶解制备抗氧化活性肽，结果表明，分子质量较低的亚麻籽粕肽的FRAP值较高，这可能是由于其包含某些活性氨基酸序列，或者具有大量疏水区的肽段特定结构，从而提高了抗氧化活性。

图7 FeSO4标准曲线

(a)大米低聚肽

(b)Vc

2.3.3 大米低聚肽的氧自由基吸收能力

Trolox标准溶液的动态荧光衰减曲线见图9，由此绘制出的标准曲线如图10所示。根据标准曲线，计算大米低聚肽和Vc的ORAC值，分别为(498.88±18.29)、(976.42±33.42)μmol/g，可见大米低聚肽的氧自由基吸收能力约为Vc的50%。尽管大米低聚肽的氧自由基吸收能力不如Vc强，但大米低聚肽作为天然抗氧化物质，已表现出较强的氧自由基吸收能力，具有很高的利用价值。推测可能由于大米蛋白酶解后，空间构型、氨基酸组成和分子空间排列等发生变化，原先包埋于蛋白质高级结构内部的抗氧化性氨基酸断裂成末端氨基酸或折叠肽段暴露出来，释放出具有抗氧化活性的小肽，产生离子化的氨基或羧基等供氢体，从而终止自由基连锁反应，达到清除或抑制自由基的目的[33]。

图9 不同浓度Trolox的动态荧光衰减曲线Fig.9 Dynamic fluorescence attenuation curve of Trolox at different concentrations

图10 Trolox标准曲线

2.3.4 大米低聚肽的还原能力

图11给出了大米低聚肽和Vc的还原能力，由图可见，大米低聚肽和Vc的吸光值均随其质量浓度的增加而增大，吸光值越大，还原能力越强，抗氧化活性就越强。这表明大米低聚肽是良好的电子供体，具有一定的抗氧化能力。贾俊强等[34]通过中性蛋白酶酶解大米蛋白制备大米肽，并研究了其还原能力，与本研究结果相似，大米肽的还原能力与其质量浓度成正比，质量浓度为1.0 g/L时吸光值约为0.085。曹辉等[35]以大米蛋白为原料，利用木瓜蛋白酶进行酶解，制备出大米肽，考察其还原能力，结果表明在质量浓度为1.0 g/L时吸光值约为0.09。本研究中大米低聚肽的还原能力均高于上述实验获得的大米肽。由于大米低聚肽具有原料易得、成本低等优点，因此作为天然安全的抗氧化剂具有广阔的应用前景。

(a)大米低聚肽

3 结语

通过二步法制备的大米低聚肽蛋白质和肽含量较高，具有良好的羟基自由基清除能力、铁离子还原能力、氧自由基吸收能力和还原能力，是一种有效的抗氧化活性肽。大米低聚肽富含亮氨酸、丙氨酸、缬氨酸等抗氧化性氨基酸，主要成分为相对分子质量1 000以下的小肽。产物为明显的球体颗粒状，表面有不规则褶皱和气孔，在270 nm波长处有最大吸收峰；二级结构以多种构象并存，主要为β- 折叠。后续研究将通过离子色谱、反相高效液相色谱、凝胶色谱等方法分离纯化大米低聚肽，鉴定高活性的抗氧化肽段，进一步明确大米低聚肽的抗氧化功能构效关系和作用机理。