复合乳酸菌发酵米发糕风味物质及储存特性

刘冬梅 邝嘉华 黄燕燕 胡金双 周钦育 余佳佳

(华南理工大学 食品科学与工程学院，广东 广州 510640)

米发糕是我国极具代表性的大米发酵食品，因其独特的柔软质地、清新的米香而受到人们的喜爱[1]。传统米发糕使用“老浆法”，即保留天然发酵的米浆作为下一次制作米发糕的发酵剂。但由于发酵体系中微生物菌群易受环境的变化影响，因此米发糕品质较难维持稳定[2]。研究发现，酵母菌与乳酸菌对淀粉食品协同发酵能改善发酵产品，如增加比容[3]、改善质构[4]、延缓淀粉老化[5]等。但其添加量过多会导致酸度过大，产品质构变差、滋味过酸[6]。多数研究关注米发糕的菌种筛选以及菌种复配的比例[7- 8]，而关于其添加量的研究较少。乳酸菌发酵剂的添加量与米发糕的口感品质息息相关，适量的添加可丰富其风味、增加其抗形变能力[9]，而添加过量会导致蛋白过度降解，影响米发糕比容[10]。此外，储藏过程中淀粉的老化、变质现象对米发糕的品质影响较大，从而限制了米发糕的商业性和产业化应用，而合适的温度和包装方法能有效提高米发糕的食用品质和货架期[11- 12]。

鉴于此，本研究对传统米发糕发酵剂进行优化，使用复合乳酸菌(植物乳杆菌与德氏乳杆菌质量比1：1)与酵母菌协同发酵，以感官评价和质构指标(硬度、弹性、胶着性、咀嚼性和回复性)对乳酸菌发酵剂添加量进行探究，并对其挥发性风味成分进行检测。同时，分别采用气调包装(50%CO2+50%N2)、真空包装和密封袋装3种包装方式，并设定4 ℃冷藏、28 ℃室温和37 ℃高温3种情况储藏米发糕，对米发糕储藏期间的感官评价、质构特性(硬度、咀嚼性)进行测定。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

籼米粉、糯米粉、白砂糖，购自广东省广州市正丰超市；植物乳杆菌DMDL9010(LactobacillusplantarumDMDL9010)分离于中国传统泡菜中，德氏乳杆菌保加利亚亚种DMDL- H1(L.delbrueckiisubsp.bulgaricusDMDL- H1)分离于内蒙古奶酪中，保藏于华南理工大学食品科学与工程学院食品质量与安全实验室；高活性干酵母，安琪酵母股份有限公司生产；MRS培养基、密封袋，购自广州卯林试剂有限公司；聚酯光面真空袋(PET+PE，13 cm18 cm)，网购；传统米发糕，市售。

TA- XT plus Texture Analyzer型质构仪，英国Stable Micro System公司生产；7890B/5799A型顶空-固相微萃取气相色谱仪，Agilent科技公司生产；ZB-WAX(30 mm×0.25 mm×0.25 μm)型毛细管柱，Agilent科技公司生产；SCIENTZ- 18N型真空冷冻干燥机，宁波新芝生物科技股份有限公司生产；5804R型高速冷冻离心机，Eppendorf公司生产；MAP- H350型复合气调保鲜包装机，苏州森瑞保鲜设备有限公司生产；DT- DZQ400ID型单式内抽真空包装机，深圳市稻田包装机械有限公司生产。

1.2 实验方法

1.2.1 发酵菌粉的制备

将保存于甘油管的两种乳酸菌分别接种至MRS液体培养基中，37 ℃下活化培养16 h，然后将100 mL种子液转接到2 L MRS液体培养基中扩大培养24 h。收集两种乳酸杆菌液后离心(8 000 r/min，10 min)，得到菌泥。添加冻干保护剂制成菌悬液后，真空冷冻干燥(-50 ℃、真空度10 Pa)38 h，得到乳酸菌冻干粉(菌体含量为107～108CFU/g)。

1.2.2 复合乳酸菌米发糕的制作

复合乳酸菌米发糕的制作流程为原料粉—过筛—原辅料混合—搅拌—发酵—蒸煮—冷却—成品。其配方以米粉100 g为标准计算：米粉100 g(籼米粉97 g、糯米粉3 g)；白砂糖10 g；水20 g；安琪酵母2 g；复合乳酸菌2、4、6、8、10 g(LactobacillusplantarumDMDL9010和L.delbrueckiisubsp.bulgaricusDMDL- H1菌粉质量比1：1)。

籼米粉和糯米粉过80目筛，加水混合，备用；用30 ℃水分别将安琪酵母粉和复合乳酸菌粉活化，接入上述面糊中，混合均匀，于28 ℃发酵14 h；白砂糖用少量水溶解，待发酵结束后加入进行调味，得到发酵面团；在蒸锅中蒸煮20 min，便可得到复合菌米发糕。

1.2.3 感官评价

感官评价标准如表1所示[13]。感官评定小组由10名来自华南理工大学食品科学与工程学院食品质量与安全实验室的学生组成。

表1 感官评价标准

1.2.4 质构特性测定

通过TA- XT plus质构仪对复合菌米发糕的质构进行测定。样品切片大小为40 mm×40 mm×20 mm，压缩试验进行2个周期和3次重复。直径为36 mm的圆柱探针以2 mm/s的速度运作，样品被压缩高度为50%，两个周期之间的时间为15 s。从力-时间图中计算得出硬度、弹性、胶着性、咀嚼性和回复性[14]。其中，硬度、胶着性及咀嚼性以力的单位N表示。

1.2.5 米发糕中挥发性风味物质的测定

通过顶空固相微萃取法(HS- SPME)提取挥发性成分[10]。称取米发糕样品5 g，移入20 mL的顶空瓶中，用聚四氟乙烯-硅橡胶垫密封压紧，于60 ℃磁力搅拌器上加热平衡15 min后，使用提前在240 ℃下预热20 min的SPME纤维萃取头(2 cm，50/30 μm DVB/Carboxen/PDMS)吸附30 min(保持60 ℃水浴)，然后将萃取头插入质谱仪进样口，解析5 min，平行实验进行3次。

GC- MS分析参考文献[15]并适当修改。色谱柱：ZB- WAX毛细管柱(30 mm×0.25 mm×0.25 μm)；载气：氦气，纯度≥99.999%；柱流速：0.8 mL/min；进样口温度：230 ℃；进样方式：萃取头在进样口解析5 min，脉冲无分流进样；柱温程序：50 ℃(5 min)，以5 ℃/min升至150 ℃，再以10 ℃/min升至240 ℃，保持10 min。

色谱-质谱接口温度：250 ℃；离子源温度：230 ℃；四极杆温度：150 ℃；离子化方式：电子电离源(EI)；电子能量：70 eV；质量范围：35～350 amu。

各组分质谱结果经NIST.11谱库进行检索，根据相似度≥80确认其香气成分，采用面积归一化法计算样品各组分的相对含量。

1.2.6 复合乳酸菌米发糕储存特性的探究

将冷却至室温的复合菌米发糕分别用密封袋装、真空包装和气调包装(50%CO2+50%N2)3种方式进行包装(每种方式包装15份)，分别置于4、28、37 ℃下进行储存。在储存第0、10、20、30、40天时，取出样品放入蒸锅中进行复蒸 5 min。按1.2.3和1.2.4节的方法进行感官评价及质构测定。

1.2.7 数据处理与分析

样品进行3次平行实验，数据采用GraphPad Prism 8.0.1作图，结果均以平均值±标准差表示。t检验用于两组样本之间的分析，当差异分析P<0.05时，认为其具有显著性。

2 结果与分析

2.1 复合乳酸菌添加量对米发糕感官品质的影响

6组不同复合乳酸菌添加量发酵所得的米发糕的感官评价结果见图1。在滋味、香味和口感方面，乳酸菌发酵剂添加量(质量分数，下同)为6%的米发糕感官评分较高，该样品具有甘醇的米香和柔和的发酵风味，而且酸甜适中；在形态与色泽方面，6组米发糕的感官评分差异不明显。研究表明，乳酸菌生长发酵面团的过程中，会产生乳酸，其可以提高米发糕中淀粉的凝胶度，降低米发糕的硬度[9]。但乳酸菌添加量过多会引起过度酸化，从而导致蛋白质过度降解，降低蛋糕的比容[16]。复配菌会影响酵母菌的产气能力，引起米发糕内部组织结构发生变化；接菌量过大时，酵母产气量与淀粉降解量均会超过临界值，导致米发糕结构坍塌。另外，微生物产生的次级代谢产物对大米淀粉、蛋白质等成分产生作用，呈味氨基酸比例增大，且以鲜味氨基酸比例增加最多，从而改变米发糕的香味、滋味[17]。综合5项感官评价指标可以得到：复合菌添加量为6%的米发糕感官得分最高。

图1 不同复合乳酸菌添加量发酵米发糕的感官评价单项指标评分Fig.1 Single index score of fermented rice cake with different additions of lactic acid bacteria

2.2 复合乳酸菌添加量对米发糕质构特性的影响

由表2可知，6组不同复合乳酸菌添加量发酵所得的米发糕在弹性和回复性上无显著性差异(P>0.05)，复合乳酸菌添加量对米发糕胶着性的影响较小，仅在添加量为4%和6%间有显著性差异(P<0.05)。硬度是评价糕点类食品最重要的指标之一[18]，米发糕的硬度和咀嚼性与米发糕的品质呈负相关[19]，口感柔软的米发糕更受消费者的喜爱。米发糕的蓬松结构受酵母产气量影响，而且淀粉被乳酸菌与酵母菌水解，其凝胶结构的致密程度下降，引起硬度下降。随着复合乳酸菌添加量的增加，米发糕的硬度和咀嚼性逐渐降低，质构发生明显改变。但复合乳酸菌添加量过多会导致口感酸化、淀粉凝胶结构松散，米发糕整体结构坍塌，因此可认为6%为米发糕较优的复合乳酸菌添加量。

表2 复合乳酸菌发酵剂添加量对米发糕质构特性的影响1)

在后续实验中，将采用6%的复合乳酸菌进行米发糕发酵，并对其进行挥发性风味物质测定及储存特性分析。

2.3 复合乳酸菌米发糕挥发性风味物质的测定分析

采用HS- SPME- GC- MS分别对市售传统米发糕和复合乳酸菌米发糕的挥发性风味物质进行分析。米发糕风味的形成由多种类型的化合物(如醇类、酯类和醛类)共同决定。由表3和图2可知，共34种主要的挥发性成分被检出，其中包括10种醇类、6种醛类、3种酯类和15种其他化合物。传统米发糕与复合乳酸菌米发糕均检出22种挥发性风味物质。传统米发糕检测出的挥发性风味物质包括：醇类8种、醛类4种、烷烃类1种、芳香烃类2种、其他类7种；复合乳酸菌米发糕检测出的挥发性风味物质包括：醇类4种、醛类5种、酯类3种、烷烃类2种、酸类1种、芳香烃类1种、其他类6种。在两组样品中，相对含量最高的挥发性成分分别是醇类(传统米发糕中相对含量为63.92%)和酯类(复合乳酸菌米发糕中相对含量为40.37%)。

表3 传统米发糕与复合乳酸菌米发糕挥发性成分组成及相对含量

图2 传统米发糕与复合乳酸菌米发糕挥发性风味物质的比较Fig.2 Comparison of aroma compounds between traditional fermented rice cake and the lactic acid bacteria fermented rice cake

醇类物质能赋予米发糕独特的米香和水果醇香[20]，在两组样品中，2-甲基- 1-丁醇和苯甲醇是共有的醇类挥发性成分。苯甲醇是一种重要的香味成分，能使米发糕和馒头等呈现新鲜的面包香味和玫瑰香[21]。酯类物质，如乙酸乙酯，具有独特的水果香味和花香味[22]，是中国米酒[23]和面包[24]的呈香物质，但仅在复合乳酸菌米发糕中被检出。这可能是因为乳酸菌与酵母菌协同发酵，促进了酯类物质的生成。就醛类物质而言，壬醛是两组样品共有的醛类物质，其具有令人愉悦的柑橘香和花香[25]。在其他化合物中，丁基羟基甲苯是米浆中常见的化合物[26]，它在两种样品中均被检出，但不呈现出特殊香气[27]。乳酸菌发酵剂丰富了米发糕中的酸类和烷烃类挥发性成分，已有研究表明，乳酸菌是中国发酵食品中合成风味的重要微生物[23]。

以上结果表明，传统米发糕与复合乳酸菌米发糕在挥发性风味物质方面具有显著性的差异，而发酵剂中的乳酸菌是引起该差异的主要原因。传统的米发糕发酵剂中菌种优势菌为酵母菌[28- 29]，其发酵产生酒精，从而使传统米发糕具有相对含量较高的醇类挥发性物质。而在复合乳酸菌发酵过程中，乳酸菌与酵母菌具有协同作用，产生酯类等风味物质，因此改变了米发糕的风味成分组成。

2.4 不同温度及包装方式对复合乳酸菌米发糕的影响

质构特性是衡量米发糕品质和保质期的一种重要指标[30]。不同温度及包装方式对复合乳酸菌米发糕的影响情况如图3所示。随储存时间的延长，3种包装方式样品的感官评分均持续下降。在第40天时，气调包装样品的感官评分显著高于其他两组样品(P<0.05)。在硬度和咀嚼性方面，随储存时间的延长，3组样品的硬度和咀嚼性均逐渐增加。密封袋与真空组样品咀嚼性分别达到88.37 N和59.03 N，而气调组仅为36.79 N。该结果与Meng等[12]的研究一致，这可能是由于气调包装样品内部具有更多疏松的小孔结构，而真空组样品及密封袋装样品的孔洞不均匀，蓬松度下降且已失去弹性，咀嚼使其可吞咽所需的功更大。在相同的储存温度下，气调包装样品表面具有更高的水分含量。气调包装有利于保持米发糕原有气孔数量、大小、密度及淀粉等高分子链的网络结构。淀粉老化是造成米发糕硬度增加的主要原因，因此，选择合适的包装方式可以有效减缓淀粉老化的速度。

*表示P<0.05，**表示P<0.01，***表示P<0.001

储存温度是影响米发糕硬度的重要因素之一[31]。在储存时间为40 d时，感官评价仅在4 ℃和28 ℃两组样品之间存在显著性差异(P<0.05)，感官评价分别为77分和86分。然而，储存温度显著影响样品的硬度和咀嚼性。4 ℃储存的样品在第40天的硬度和咀嚼性最高，分别达到53.97 N和46.90 N。28 ℃和37 ℃两组样品硬度分别为40.48 N和46.90 N，而在咀嚼性方面无显著差异。这是因为淀粉老化机制的主要因素是温度[32]。淀粉的老化往往会导致米发糕品质下降以及货架期缩短[33]，淀粉凝胶在4 ℃下储存比在 30 ℃时结晶更快[34]。如图3(e)、3(f)所示，4 ℃组样品的硬度和咀嚼性增加幅度比其他两组更大。米发糕内部分子分散相的凝聚、沉淀以及支链淀粉形成凝胶结构体，都影响米发糕的松软口感，增加硬度及咀嚼性。综合考虑两种情况，可以认为：以气调包装(50%CO2+50%N2)，并储存于28 ℃有利于保持复合乳酸菌米发糕的感官品质。

3 结论

文中实验添加两种乳酸菌作为发酵剂，与安琪酵母协同发酵米发糕，并对发酵菌添加量进行探究。实验结果表明，当复合乳酸菌添加量为6%时，米发糕的感官品质较优、口感松软，在硬度和咀嚼性上有显著改善。此外，由HS- SPME- GC- MS检测出，复合乳酸菌米发糕与传统米发糕共有34种挥发性风味物质，两组风味物质组成有明显差异。复合乳酸菌米发糕的挥发性成分中具有更丰富的酯类化合物，因此，在米发糕发酵过程中，选择乳酸菌作为复合发酵剂能有效提升米发糕的感官品质。本实验还对复合乳酸菌米发糕的储存特性进行了研究，结果表明，以气调包装并储存于28 ℃可以减缓淀粉老化速度，保持米发糕较优的口感和品质，有利于米发糕的保存。但是本文在关于乳酸菌对米发糕淀粉老化方面的研究还不够深入，今后可通过流变、食品物性分析、差示扫描量热分析、低场核磁共振呈像分析等技术进行下一步研究。