血清外泌体miR-338在老年食管癌中表达及诊断价值

冯世军 饶钟茗 韩冰 郭伟

(驻马店市中心医院 1心脏大血管外科，河南 驻马店 463000；2胸外科)

食管癌也称食道癌，其发病率在逐年上升〔1,2〕，因此早期发现并及时治疗食管癌是降低死亡率的有效手段。临床主要采用X线造影、脱落细胞学及内镜技术等相结合来早期诊断食管癌，使高危人群中食管癌的检出率大大提高，但操作复杂、检测时间长且给患者带来较大痛苦〔3～5〕。因此寻求理想血清标志物来早期诊断食管癌在临床上意义重大。外泌体是大小均一的囊泡样小体，是细胞主动向细胞外分泌所产生，其在细胞之间有运送生物活性分子的作用〔6〕。外泌体在缺氧环境下分泌增加，其携带的核酸(包括miRNA)和蛋白质在信号转导作用下，在肿瘤微环境中进一步使肿瘤异质化、诱导肿瘤转移、促进血管生成等〔7，8〕。miR-338是miRNA家族一员，王文静等〔9〕研究发现，miR-338基因簇在胃癌组织中表达水平显著低于癌旁组织，提示miR-338可能是抑癌基因参与胃癌的发生。目前，有关血清外泌体miR-338在食管癌中的表达水平及诊断价值研究鲜有报道。本研究对食管癌患者血清外泌体miR-338表达水平及诊断价值进行分析。

1 资料与方法

1.1临床资料 选取2018年1月至2019年9月于驻马店市中心医院就诊的老年食管癌患者32例作为观察组，男25例，女7例；年龄60～78岁，平均(68.32±8.13)岁。另选取同期在驻马店市中心医院治疗的老年食道良性病变患者35例作为对照组，男27例，女8例；年龄60～79岁，平均(69.18±9.04)岁。诊断标准：参照中国抗癌协会食管癌专业委员会编撰的《食管癌规范化诊疗指南》〔10〕。纳入标准：①初治患者；②未接受其他抗癌治疗；③临床资料完整患者。排除伴有其他癌症患者。两组性别、年龄比较差异无统计学意义(P>0.05)。本研究经医院医学伦理委员会同意。所有受试对象签署知情同意书。

1.2主要仪器与试剂 RT-PCR分析仪(型号7500)、分光光度计(型号UV-3672)、生物分析仪(型号Agilent2100)均购自美国ABI公司；透射电子显微镜(型号Tre-100bm)购自日本电子公司；Nano sight纳米粒度仪(型号GH8935K)购自英国Nanosight公司；外泌体提取试剂盒ExoQuick-TM(货号ND4672-8)、SYBR Premix ExTaq试剂盒(货号N5643MJ)购自美国Sigma公司；PrimeScript RT reagent试剂盒(货号ND6527J)均购自购自北京中杉金桥公司；CD9抗体(货号GH8935K)、CD63抗体(货号627925)、TSG101抗体(货号M78320J)、Calnexin抗体(货号67869NJ)均购自美国Bioworld公司；羊抗兔二抗(货号O6721D)购自北京博奥森生物技术有限公司；TRIzol试剂(货号MN562J2)购自苏州泓迅生物科技股份有限公司。

1.3血清外泌体的提取与鉴定 收集患者外周血，离心分离血清并置于新的EP管中，于-80℃冰箱保存待用。(1)严格按照ExoQuick-TM试剂盒说明书提取血清外泌体，用磷钨酸将得到的外泌体样品染色后，用透射电子显微镜观察颗粒形态。(2)用Nano Sight纳米粒度仪对外泌体颗粒浓度进行检测，在10 000倍数下稀释样品，阈值为5，检测过程中各参数保持不变。(3)采用Western印迹对外泌体表面标志蛋白CD9、CD63、TSG101、Calnexin进行检测。

1.4实时荧光定量PCR法检测血清外泌体miR-338水平 采用TRIzol试剂提取血清外泌体中总RNA，以分光光度计检测miR-338浓度，用生物分析仪检测所分离的miR-338纯度，OD 260 nm/280 nm值在1.8～2.0范围，代表提取的RNA合格。以RNA为模板，按照PrimeScript RT reagent试剂盒说明书进行逆转录反应得cDNA。以cDNA为模板，参照SYBR Premix ExTaq试剂盒说明书，进行荧光定量PCR，反应体系(10 μl)：cDNA模板(50 ng/μl)1.5 μl，正反向引物(10 μmol/L)各0.6 μl，SYBR Green Mix 6 μl，dH2O 1.3 μl。反应条件：95℃ 30 s；95℃ 10 s，60℃ 15 s，72℃ 20 s，40个循环。以U6作为内参，以(RQ)=2-ΔΔCt方法表示血清外泌体miR-338相对表达量。miR-338、U6引物均由上海生工生物工程有限公司合成，引物序列见表1。

1.5血清外泌体miR-338与临床病理特征关系的方法 依据血清外泌体miR-338的表达水平结果，将观察组患者分成高表达组17例和低表达组15例，分析血清外泌体miR-338与肿瘤分级、淋巴结状况、临床分期等临床病理参数的关系。

1.6统计学方法 采用SPSS19.0软件进行t、χ2检验。绘制受试者工作特征(ROC)曲线分析血清外泌体miR-338水平对老年食管癌的诊断价值。

2 结 果

2.1血清外泌体的鉴定 Nano Sight检测结果显示，样品中颗粒主要分布于35～200 nm，且分散均一，直径呈单峰正态分布曲线，峰值约在55 nm处(图1)。外泌体样品经染色后于透射电镜下观察，圆形脂质双层膜囊状颗粒清晰可见，直径约为150 nm(图2)。Western印迹结果显示，外泌体样品稳定表达CD63、TSG101、CD9外泌体标志蛋白，而不含细胞成分Calnexin蛋白(图3)。以上方法表明，纯化样品中含有大量外泌体颗粒，且具备外泌体特性。

图1 Nano Sight检测结果

图2 透射电镜观察结果(×50 000)

图3 Western印迹检测结果

2.2两组血清外泌体miR-338表达水平 与对照组比较，观察组血清外泌体中miR-338表达水平显著降低(0.51±0.18 vs 0.25±0.09，t=7.369，P=0.000)。

2.3老年食管癌患者血清外泌体miR-338表达水平与临床病理参数关系 低表达组年龄≥68岁患者比例、有淋巴结转移及临床Ⅲ～Ⅳ分期患者比例明显高于高表达组(P<0.05)。见表2。

表2 血清外泌体miR-338表达水平与老年食管癌患者临床病例参数关系〔n(%)〕

2.4血清外泌体miR-338表达水平对老年食管癌诊断价值 ROC曲线结果显示，血清外泌体miR-338水平预测老年食管癌的AUC为0.918(95%CI：0.863～0.974)，截断值为0.360 pg/ml，灵敏度和特异度分别为84.5%、86.3%。见图4。

图4 血清外泌体miR-338表达水平对老年食管癌诊断ROC曲线

3 讨 论

食管癌有较高发病率及致死率，由于其早期症状不明显，因此患者在确诊时往往已是中晚期，给患者家庭和生活方面带来严重影响〔11,12〕。因此如何早期诊断并及时治疗食管癌，在临床尤为重要。

外泌体是从细胞中释放出的最小的细胞外囊泡之一，具有脂质双分子层结构。细胞内内陷的溶酶体微粒形成多囊泡体，经刺激后，多囊泡体与质膜融合进而向胞外释放外泌体〔13,14〕。外泌体可以包裹、传递miRNA、DNA及蛋白等多种重要物质，与肿瘤的生长和转移密切相关，肿瘤周围组织细胞分泌的外泌体具备杀伤肿瘤细胞的能力，且外泌体的采集不受血液数量及存储时间的限制，具有血清学研究不可比拟的优势〔15〕。Liu等〔16〕研究发现，外泌体运送的miR-93-5p基因能够促进食管癌细胞增殖，并影响细胞周期蛋白D1的表达。本研究成功提取并鉴定血清外泌体。成熟miRNA是长度为20～23个核苷酸(nt)的单链RNA分子，是基因表达的重要调节剂，通常会降低mRNA稳定性，包括介导肿瘤发生过程基因的mRNA。miRNA靶向主要是通过miRNA 5′端(“种子”区域)与mRNA编码区和非翻译区(UTR)内的位点之间的特定碱基配对相互作用实现的〔17〕。miRNA通过转录后抑制基因表达来调节细胞生长和代谢〔18〕。Yan等〔19〕研究发现，miR-338在食管鳞状细胞癌组织中的表达比相应癌旁组织显著降低，是食管鳞状细胞癌的抑癌基因。但目前有关血清外泌体miR-338在老年食管癌中的临床意义鲜有报道。本研究提示血清外泌体miR-338异常表达与食管癌的发生发展密切相关。血清外泌体miR-338表达水平与患者年龄、淋巴结转移、临床分期有相关性。血清外泌体miR-338水平对食管癌有较高诊断价值。

综上，血清外泌体miR-338有望成为临床上诊断老年食管癌的新型生物标志物。本研究存在一定不足，样本量较少，后期应加大样本量对血清外泌体miR-338在食管癌中的具体作用机制作进一步研究。