YAP1、miR-31与老年卵巢癌患者微血管密度的关系

江娜 王秀虹 程欣

(咸宁市中心医院妇科，湖北 咸宁 437100)

卵巢上皮癌多发生在40岁以上〔1,2〕，症状包括腹胀、骨盆疼痛、腹部肿胀和食欲不振等，因此能够及时评估患者当时病情程度尤为重要〔3〕。研究表明〔4〕，卵巢癌可导致异常细胞有能力侵入或扩散到身体的其他部位且发生重要病理改变，Yes相关蛋白(YAP)1、miR-31及微血管密度(MVD)均参与了这个过程。研究指出，YAP1、miR-31及MVD与卵巢癌有关系，可以作为卵巢癌病理改变的有效观察指标〔5〕。吴东雅等〔6〕研究指出，YAP1基因不仅可以参与维持器官的大小，还可作为癌基因与人类肿瘤形成密切相关。徐志宏等〔7〕研究提出，miR-31是卵巢癌的独立危险因素，但在国内与此相关的研究较少。Esencan等〔8〕研究提出，血管生成可通过灌注效应及转移效应，可促进肿瘤的生长及浸润、转移，其中包括卵巢癌在内的实体肿瘤普遍存在的病理现象。本文拟分析YAP1、miR-31与老年卵巢癌患者MVD的关系。

1 对象与方法

1.1研究对象 选取2019年1月至2021年1月在咸宁市中心医院治疗的老年卵巢癌患者105例作为卵巢癌组，选取行健康体检的63例作为卵巢良性病变组。卵巢癌组年龄60～73岁，平均(63.17±6.18)岁，病程1.0～3.5年，平均(2.13±1.19)，症状：肠道压迫感39例、腹胀32例、骨痛34例，流产史5例，月经紊乱史48例，胃肠胀气史52例；根据患者检查结果及依据癌细胞转移部位、有无发生远处转移将其分为早期、中期、晚期3组，分组参考《2017年第4版NCCN卵巢癌临床实践指南》〔9〕中对其严重程度的评判标准。卵巢良性病变组年龄60～72岁，平均(62.70±5.70)岁，症状：肠道压迫感25例、腹胀27例、骨痛11例，流产史6例，月经紊乱史20例，胃肠胀气史37例；本研究经医院伦理委员会批准后，所有研究对象及家属签署知情同意书，两组一般资料差异无统计学意义(P>0.05)。纳入标准：卵巢良性病变组存在腹部压迫痛、小便痛；卵巢癌组符合《2020NCCN卵巢癌包括输卵管癌及原发性腹膜癌临床实践指南(第1版)》〔10〕中对卵巢癌的诊断标准，且患者均存在腹胀、恶心、呕吐等消化道等症状。排除标准：肾脏功能严重受损或心力衰竭、阴道流血不止、存在其他腹部疾病、严重感染性疾病者、智力障碍、合并恶性肿瘤、凝血功能障碍、病例重复患者、依从性差。

1.2主要设备 试剂及化学物品均为国产分析纯。

1.3YAP1、miR-31检测 取患者卵巢组织后置入10%甲醛溶液固定24 h，常规石蜡包埋，连续切片，在取出样本中的组织采用免疫组化检测YAP1、miR-31表达水平，兔抗人YAP1、miR-31、MVD、血管内皮生长因子(VEGF)单克隆抗体、免疫组化检测，试剂盒分别购自武汉菲恩生物科技有限公司、上海雅吉生物科技有限公司、武汉维克赛思科技有限公司，胞膜及胞质内呈现棕黄色的颗粒表示为阳性细胞，每张切片在高倍镜下选出5个视野，最后加入苏木素给予复染，盐酸乙醇分化后，梯度乙醇进行脱水，用二甲苯冲洗片至透明后进行中性树脂封片处理，显微镜下观察免疫组化染色情况；根据染色细胞百分比和染色程度进行评估,根据染色程度和染色细胞百分比进行评估：阳性细胞数>5%计为阳性例数，计数标准为0%～5%(-)，6%～20%(+)，21%～50%()，51%～100%()。

1.4YAP1、miR-31、MVD水平检测 采用实时荧光定量PCR测定YAP1、miR-31、MVD表达量，利用PCR试剂盒合成cDNA。逆转录：14 μl模板RNA、2 μl Enzyme mix，4 μl 5×RT缓冲液，补至20 μl，在PCR检测仪上42℃ 1 h、95℃ 5 min，之后将所合成的cDNA放置于温度为-20℃环境下进行保存。将血液放在不加抗凝剂的试管中，血液凝固将血清吸出。随后将血液放在乙二胺四乙酸(EDTA)的试管中后将血浆吸出。采集完成后马上进行检测，将抽取血放在取血器后加缓冲液，混匀61 s后将试剂卡滴3滴混合液，插入试剂卡等待185 s，即为YAP1、miR-31、MVD检测结果。

1.5VEGF水平检测 抽取患者清晨空腹静脉血4 ml，离心5 cm、3 000 r/min离心10 min，分离出的上层血清，在-45℃环境下保存，采用酶联免疫吸附试验检测VEGF水平；制作标准品，以1∶2的稀释液稀释样品；在反应孔中加入已稀释的标准品100 μl/孔，在35℃恒温孵育箱中湿育2 h；用洗涤液将反应板洗3次后，加入1∶100倍稀释后的抗体工作液100 μl/孔，放于35℃环境中湿育45 min；在反应孔内加入TMB溶液100 μl/孔，置于35℃环境45 min后在反应孔内加入终止液用来终止反应，在450 nm波长测定吸光度，经绘制标准曲线计算VEGF水平(颜色反应深浅与VEGF呈正比)。

1.6统计学处理 采用SPSS26.0软件行方差齐性检验、t检验、Logistic分析及Pearson相关性分析。

2 结 果

2.1两组YAP1、miR-31表达比较 与卵巢良性病变组相比，卵巢癌组YAP1表达量显著升高，miR-31表达量显著降低(P<0.05)，见图1,表1。

表1 两组YAP1、miR-31表达比较

2.2两组MVD、VEGF水平比较 与卵巢良性病变组相比，卵巢癌组MVD、VEGF水平显著升高(P<0.05)，见表2。

表2 两组MVD、VEGF水平比较

2.3发生中晚期卵巢癌影响因素的多元Logistic回归分析 将发生中晚期癌变(早期=0，中晚期=1)作为因变量，将YAP1、miR-31及MVD作为自变量，纳入二分类多因素 Logistic回归模型分析，结果显示，YAP1、miR-31及MVD为影响中晚卵巢癌发生的因素(P<0.05)，见表3。

表3 发生中晚期卵巢癌影响因素的多元Logistic回归分析

2.4YAP1、miR-31与MVD相关性 YAP1与miR-31呈负相关(r=-0.028，P=0.008)，与MVD呈正相关(r=0.010，P=0.001)；miR-31与MVD呈负相关(r=-0.017，P=0.003)，见图2。

图2 YAP1、miR-31与MVD的相关性

3 讨 论

卵巢癌是来源于卵巢与输卵管的恶性肿瘤,随着疾病进展,也会转移到身体其他部位，是目前所认为多种危险因素综合作用的结果，对于平均风险的女性，不建议进行筛查，因为证据不支持减少死亡，且高误报率可能导致不必要的手术，伴随自身的风险〔11〕。临床上，通过对卵巢癌患者进行病理测定，可判断其疾病严重程度。如何判断卵巢癌患者疾病严重程度，应作为早期诊断卵巢癌的研究策略。

卵巢癌是一种易转移、侵袭能力强的妇科恶性肿瘤，且复发率及死亡率极高。因此发现卵巢癌发生及发展过程有关键作用〔12〕。YAP1可作为癌基因与人类肿瘤形成的重要指标，在研究中通过对小鼠的实验中发现〔13〕，乳腺癌肿瘤组织中存在具有潜在促癌作用的YAP1基因，可诱导细胞增殖并有效抑制细胞凋亡。在生理状态下，YAP1可作为Hippo信号转导通路下游的靶因子，可维持机体内环境的稳态及组织器官的正常大小。有研究表明〔14〕，YAP1在一些肿瘤中表达增强，如胃癌、肝癌、卵巢癌等肿瘤组织中表达水平异常增高，提示此指标活性增强，其与肿瘤发生及发展有一定关系。另有研究表明〔15〕，YAP1过度表达可使肝癌患者肝脏显著增大，最终导致肿瘤的形成。尽管YAP1在肿瘤形成过程中发挥重要作用，但在卵巢癌的表达水平及临床特征之间的关系鲜有报道，本研究结果推测YAP1卵巢癌发生及发展中可能发挥作用。本研究发现YAP1在正常水平下可维持机体内环境的稳态及组织器官的正常大小且在卵巢癌发生及发展过程有关键作用，但目前有关YAP1在卵巢癌中作用的研究尚少，故需进一步探究。

MiRNA在卵巢癌领域的研究中备受关注，它是最近几年新发现的肠胃21～26个核苷酸的RNA，在人体内发挥很多生物学作用，且具有预后评价、早期诊断的指导价值，可能成为卵巢癌新的治疗靶点，具有极高的生物应用价值〔16,17〕。在已发现的miRNAs中，miR-31是调节恶性肿瘤生物学行为的关键基因，有研究报道〔18〕，在结肠癌细胞体系中，miR-31可通过MTI等靶基因增加恶性肿瘤细胞迁移，通过抑制miR-31可快速增强SW480细胞的迁移。另有研究表示〔19〕，在乳腺癌中miRNA是一种抑癌基因，相反在结肠癌中miR-31的表达增强可促进肿瘤的发展，因此认为miR-31在不同肿瘤中截然不同的表达现象在很多实验中都得到了相应印证，然而，miR-31在卵巢癌中的临床意义及预后的价值尚未研究。本研究结果发现，miR-31可能是卵巢癌的一个新诊断及预后标志物。

卵巢癌的发生及发展依赖于新生血管的生成，肿瘤细胞通过合成及分泌血管生成因子，可调节肿瘤组织的血管生成〔20〕。VEGF、MVD是肿瘤血管发生过程中的主要正性调控因子，可促进血管生成并参与肿瘤的发展过程，VEGF、MVD可通过作用于特异受体而发挥相应性生物学作用。VEGF、MVD可通过作用于血管内皮细胞上的受体诱导血管的形成，间接促进肿瘤细胞的生长，还可通过作用于肿瘤细胞上的受体，直接促进肿瘤生长。本研究结果与上述结果一致，提示VEGF、MVD可参与卵巢癌的发生及发展，且与卵巢癌细胞增殖密切相关。有研究发现〔21〕，VEGF、MVD通过与其相应受体结合等多种机制参与其中，可促进卵巢癌细胞的生长、血管形成等，MVD可作为预测肿瘤转移潜能及恶性肿瘤生成的指标。本文结果提示YAP1、miR-31、MVD可能共同参与卵巢癌的发生发展，临床可根据其高低评估病情严重程度。以上结果说明YAP1、MVD的升高及miR-31的降低可加重疾病与肿瘤恶化程度。

综上，YAP1、miR-31、MVD在卵巢癌中具有一定相关性，其水平的异常表达可加重疾病与肿瘤恶化程度，可用于卵巢癌患者的临床诊断。