Aβ1～42对阿尔茨海默病小鼠PI3K/PKB信号通路的影响

张寨南 林茂 胡云 王春梅

(遵义医科大学珠海校区 1生理学教研室，广东 珠海 519000；2生物工程系)

阿尔茨海默病(AD)是一种多发于老年期、以渐进性记忆和认知功能减退为主要特征的中枢神经系统退行性疾病〔1〕。核心致病学说“淀粉样级联假说”认为，β淀粉样蛋白(Aβ)在AD致病过程中起着关键作用，由于病理改变等原因，导致淀粉样蛋白前体蛋白(APP)的数量异常增多，增多的Aβ进而激活神经胶质细胞，产生多种炎症介质，对神经元及神经突触造成直接损害，最终Aβ在脑内沉积形成老年斑，导致AD神经元变性和痴呆产生〔2〕。因此，认为Aβ的沉积是AD病理过程的关键因素与环节。近年来研究发现，中枢胰岛素信号转导通路受损与Aβ异常代谢互相关联〔3〕。胰岛素信号转导途径主要是指胰岛素与胰岛素受体(InR)结合导致受体的酪氨酸激酶被激活，激活的酪氨酸激酶由此启动磷酸化级联反应，将信号传导至靶点并介导启动多种生理学效应的过程〔4〕。胰岛素信号通路主要有3条：磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B(PI3K/PKB)途径、PI3K/PKC途径和有丝裂原活化蛋白酶(MAPK)途径〔5〕。Aβ参与的信号转导与蛋白酪氨酸激酶(PTK)有关，PTK能激活糖原合成酶激酶(GSK)-3β，GSK-3β位于胰岛素PI3K/PKB信号通路中，是Tau蛋白磷酸化的重要激酶，能够引起Tau蛋白磷酸化〔6，7〕。本文通过建立AD小鼠模型，研究Aβ1～42在PI3K/PKB信号通路的影响机制。

1 材料与方法

1.1仪器与材料 万分之一天平(上海精密科学有限公司)，DYY-8c型电泳仪(北京六一公司)，G-Box HR全自动凝胶成像分析系统(美国Bio-Rad)，Centrifuge 5415R冷冻高速离心机(美国Gene)，STT-2型小鼠跳台仪(北京科学院研究所)。Aβ1～42、链脲佐菌素(STZ)、人工胰岛素购自Sigma公司；p-Tau抗体、p-PKB抗体、p-GSK-3β、β-actin抗体购自Abcam公司；酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒购自上海经科化学有限公司。SD小鼠，雄性，体重(20±2)g，广东省医学实验动物中心提供，许可证号：SCXK(粤)2008-0002。

1.2模型制备与动物分组 侧脑室注射STZ 3 mg/kg制备AD模型，随机分为6组：假手术组、模型组、Aβ1～42低剂量(0.015 mg/kg)组、Aβ1～42中剂量(0.050 mg/kg)组、Aβ1～42高剂量(0.150 mg/kg)组、胰岛素组，每组10只，造模14 d，Aβ1～42低、中、高组侧脑室注射不同剂量的Aβ1～42，胰岛素组侧脑室注射人工胰岛素1 U(100 U/m1)；假手术组和模型组注射等体积的生理盐水。

1.3跳台实验检测小鼠认知功能 末次给药后，先将小鼠放置于跳台仪内适应4.0 min，随即将跳台仪通电。小鼠遭受电击，正常反应为躲避电击跳上绝缘台。小鼠5.0 min内跳下绝缘台次数记录为学习成绩。第2天同一时间再次将小鼠放置于绝缘台，其5.0 min内第1次从台上跳下时间记录为潜伏期。同时小鼠于5.0 min内跳下绝缘台总次数记录为错误次数。

1.4ELISA试剂盒检测小鼠海马InR 跳台实验后各组小鼠断头取脑，剥离海马，取适量海马组织匀浆，4℃ 3 000 r/min离心10 min取得待测样本，严格按照试剂盒说明书检测InR含量。

1.5Western印迹法检测小鼠海马p-Tau、p-PKB和p-GSK-3β 提取各组小鼠海马组织蛋白，二喹啉甲酸(BCA)法测定蛋白浓度，行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，后蛋白转移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。5%BSA室温下封闭1 h，分别加入一抗p-Tau、p-PKB和p-GSK-3β、β-Actin，4℃封闭过夜。磷酸盐缓冲液(PBS)清洗3次，加二抗，室温孵育1 h。在全自动凝胶成像仪中曝光、显影，以目的条带灰度值与内参(β-actin)条带平均灰度值的比值统计分析数据。

1.6数据分析 采用SPSS20.0软件进行单因素方差分析、LSD-t检验。

2 结 果

2.1跳台实验结果 与假手术组比较，模型组练习错误和记忆错误次数显著增多、潜伏期显著缩短(P<0.05)；与模型组比较，Aβ1～42不同剂量组练习和记忆错误次数显著增加、潜伏期显著缩短(P<0.05，P<0.01)，胰岛素组练习和记忆错误次数显著减少、潜伏期显著增加(P<0.05，P<0.01)。见表1。

表1 各组跳台实验成绩结果

2.2Aβ1～42对各组小鼠海马InR含量的影响 与假手术组〔(24.56±0.713)ng/ml〕比较，模型组InR表达量〔(13.38±0.923)ng/ml〕明显降低(P<0.05)。与模型组比较，Aβ1～42低、中、高剂量组InR表达量〔(8.88±0.576)ng/ml、(7.08±0.540)ng/ml、(5.36±0.817)ng/ml〕明显降低(P<0.01)；胰岛素组InR表达量明显升高〔(19.88±1.858)ng/ml,n=5,P<0.01〕。

2.3Aβ1～42对各组小鼠海马p-Tau、p-PKB和p-GSK-3β蛋白表达量的影响 与假手术组比较，模型组p-PKB、p-GSK-3β蛋白表达量明显降低，p-Tau表达量明显升高(P<0.05)。与模型组比较，Aβ1～42不同剂量组p-PKB、p-GSK-3β蛋白表达量明显降低，p-Tau表达量明显升高(P<0.05，P<0.01)；胰岛素组p-PKB、p-GSK-3β的表达量升高，p-Tau表达水平明显降低(P<0.05，P<0.01)。见图1、表2。

1～6：假手术组、模型组、Aβ1～42低剂量组、Aβ1～42中剂量组、Aβ1～42高剂量组、胰岛素组图1 各组海马p-Tau、p-PKB和p-GSK-3β蛋白表达

表2 各组海马p-Tau、p-PKB和p-GSK-3β蛋白表达比较

3 讨 论

研究发现AD早期病理紊乱信号常表现为葡萄糖代谢减弱及胰岛素信号通路障碍〔8，9〕。本研究中采用了双侧侧脑室注射STZ诱导小鼠认知功能障碍模型。通过侧脑室内注射STZ可持续的减少脑内葡萄糖摄入，使得葡萄糖代谢减弱，进而使脑内的胰岛素受体不敏感，引发胰岛素信号障碍，最终诱导类似于AD的病理学和行为学特征，如神经元变性、突触缺失、Aβ异常增加、神经炎症的产生、认知功能减弱等〔10〕。本实验结果显示，双侧侧脑室注射 STZ 导致小鼠脑内特征病理蛋白tau蛋白明显升高，记忆学习功能减退，提示本研究模型制备成功。

本实验结果提示Aβ1～42能够对AD早期病理改变、学习记忆等认知功能产生影响，且可以干扰胰岛素信号通路功能，该影响的具体机制与抑制PI3K/PKB信号通路相关蛋白InR、p-PKB、p-GSK-3β的表达有关。

AD致病过程中Aβ可形成多种动态过渡结构，包括复杂的单体、不同类型的寡聚体及原纤维，这些动态结构最终自发性聚集形成老年斑，产生神经毒性。其中，属Aβ1～42具有较强的神经毒性〔10〕。Aβ可提高小胶质细胞中p38MAPK的活性，且可通过PI3K/PKB信号通路途径诱导tau蛋白过磷酸化，发挥神经毒性〔5〕。本实验中不足之处在于只针对胰岛素信号通路的PI3K/PKB途径进行了探讨，对MAPK及PI3K/PKC途径未做深入研究，胰岛素信号通路异常仅引起蛋白异常反应或是基因靶点异常也无法明确，因此，针对Aβ1～42在AD致病过程是如何通过影响胰岛素信号通路产生毒性作用值得我们进行深入的多角度的综合性研究。

胰岛素信号通路是一种复杂的、跨越多种疾病的生理信号通路。近年来研究发现，胰岛素信号通路异常可触发内质网应激产生异常蛋白反应〔11〕。除了广泛研究的糖尿病之外，许多其他疾病也与异常蛋白折叠反应及蛋白质表达失衡密切相关，这些疾病包含神经退行性疾病，如肌萎缩性脊髓侧索硬化症和AD〔12，13〕。此外，新的研究发现肠道胰岛素/胰岛素生长因子(IGF)1信号通过叉头框转录因子(FoxO)1调节上皮完整性和对结肠癌的易感性〔14〕。因此，通过研究和理解胰岛素信号通路在维持蛋白质内环境稳定方面发挥的更广泛的作用，可能也会开发出治疗神经退行性疾病及其他疾病的新方法。