miR-187在骨质疏松性骨折患者血清中表达及其作用机制

张涛 杨扉扉 王藜篥 黄华 张松 曹永飞

(贵州省骨科医院骨外科，贵州 贵阳 550002)

骨密度(BMD)降低是导致骨质疏松性骨折的重要原因〔1〕。骨质疏松与骨代谢失衡密切相关，成骨细胞造骨量与破骨细胞吸收量处于动态平衡，若破骨细胞增加可导致骨质疏松的发生〔2，3〕。因而深入探究骨质疏松的发病机制并抑制破骨细胞活性可为该疾病的防治提供新方向。既往研究表明微小RNA(miRNA)在破骨细胞增殖及凋亡等生物学过程中发挥重要调控作用，而早期预测骨质疏松骨折风险有利于该疾病的预防与治疗〔4，5〕。微小RNA-187(miR-187)在骨质疏松性骨折患者中低表达，miR-187过表达可促进成骨前体细胞增殖并抑制其分化〔6〕。有报道指出Notch信号通路与破骨细胞增殖及凋亡有关〔7〕。但miR-187是否通过调控Notch信号通路而影响破骨细胞增殖及凋亡尚未可知。本研究主要探讨miR-187与Notch信号通路的相关性及其对骨质疏松的影响。

1 资料与方法

1.1临床资料 选取2017年5月至2018年6月贵州省骨科医院收治的60例骨质疏松性骨折患者作为实验组，50例骨折但未发生骨质疏松患者作为对照组，实验组与对照组年龄、性别与体重指数(BMI)相比差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。同时应用双能X线骨密度仪(上海企晟医疗器械有限公司)检测两组患者腰椎正位总体L1～4 BMD。实验组患者均符合骨质疏松性椎体骨折诊断标准〔8〕。纳入标准：患者均经影像学诊断为椎体骨折。排除标准：炎症或占位性病变等引起的病理性骨折；既往椎体受伤病史；患有椎管狭窄及爆裂性椎体骨折；合并心脑肝等重要脏器损伤患者；药物引发的继发性骨质疏松患者；强直性脊柱炎或类风湿性关节炎患者；近期服用影响骨代谢药物者。本研究经医院伦理委员会批准，所有患者知情且签署同意书。两组均于入组后次日清晨抽取空腹外周静脉血2 ml，4℃条件下经3 000 r/min离心10 min(离心半径3 cm)，吸取血清置于离心管内，放入-20℃超低温冰箱保存待测。

表1 两组临床资料对比

1.2大鼠实验

1.2.1主要试剂 10只清洁级SD大鼠，体重70～120 g，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，动物许可证号：SCXK(湘)2016-0008。杜氏改良培养基(DMEM)、胰蛋白酶购自上海玉博生物科技有限公司；胎牛血清(FBS)购自美国Gibco公司；Trizol试剂购自北京全式金生物技术有限公司；逆转录及实时定量 PCR(qRT-PCR)试剂盒购自北京天根生化科技有限公司；甲基噻唑基四唑(MTT)试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司；膜联蛋白V(Annexin V)-异硫氰酸荧光素(FITC)/碘化丙啶(PI)细胞凋亡试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司；RIPA蛋白裂解液购自美国Sigma公司；兔抗鼠细胞周期蛋白(Cyclin)D1、p21、B淋巴细胞瘤(Bcl)-2、Bcl-2相关蛋白(Bax)多克隆抗体购自北京博奥森生物技术有限公司；兔抗鼠Notch1、Jagged1、Delta样蛋白(DLL)3、Notch2抗体购自美国Abcam公司；辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗兔IgG二抗购自武汉博士德生物工程有限公司；Lipofectamine2000购自北京索莱宝科技有限公司；miR-187模拟物(mimics)及阴性对照均购自上海吉玛公司。

1.2.2骨质疏松大鼠模型建立 取SD大鼠，禁食12 h，将0.5 g的阿托品注射入大鼠肌肉内，使用水合氯醛(体积分数3.6%)麻醉大鼠，消毒与铺巾，从大鼠背部正中作为切口并取出肋缘下侧双侧卵巢，缝合切口，使用无菌纱布与油纱双层敷料覆盖创伤面，包扎后给予抗生素，目的是预防感染，待大鼠清醒后常规饲养，检测大鼠血、尿与骨骼参数等判断造模是否成功〔9〕。

1.2.3大鼠原代破骨细胞分离及培养 10只大鼠均造模成功，采用颈椎脱位法处死大鼠，乙醇消毒后取大鼠两侧股骨、胫骨及其周围软组织，去除两端骨骺，骨髓腔暴露，采用DMEM培养基(50 ml)冲洗骨髓腔直至其骨面变白，白色沉淀物即为破骨细胞样细胞团，加入含有10% FBS的DMEM培养基制备细胞悬液，轻轻吹打混匀，用200目细胞筛过滤细胞悬液，取过滤后的细胞悬液，调整细胞浓度至1×106个/ml，轻轻吹打混匀，接种至培养瓶，置于37℃、体积分数5%CO2培养箱培养12 h，更换培养液，每隔2 d更换一次培养液，置于显微镜下观察细胞形态〔10〕。破骨细胞培养于含有10% FBS、青霉素及链霉素的DMEM培养基，置于37℃、体积分数5%CO2培养箱内培养，待细胞生长融合度达到80%时进行传代培养，待细胞稳定传代3～5代后，取对数期破骨细胞进行后续研究。

1.2.4细胞转染及实验分组 取对数期破骨细胞，参照Lipofectamine2000试剂说明书分别将miR-187 mimics、miR-con转染至破骨细胞，分别命名为miR-187组、miR-con组。转染前1 h将培养液更换为不含血清的培养基，转染6 h后将培养基更换为含有10%FBS的DMEM新鲜培养基，继续培养48 h，收集细胞。同时将不转染任何基因且正常培养的破骨细胞作为NC组。

1.2.5qRT-PCR检测miR-187相对表达量 取出冻存血清及各组破骨细胞，采用Trizol法提取总RNA，应用紫外分光光度计测定RNA浓度，参照反转录试剂盒将RNA合成cDNA。miR-187正向引物5′-TCGTGGGTCGTGTCTTGTGTTGC-3′，反向引物5′-GCAGGGTCCGAGGTATTC-3′；U6为内参，正向引物5′-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3′，反向引物5′-GGAACGCTTCACGAATTTG-3′，引物均由上海生工生物工程股份有限公司合成。严格按照qRT-PCR检测试剂盒说明书配制反应体系，置于ABI 7500实时荧光定量PCR仪检测，qRT-PCR反应条件：95℃预变性5 min循环1次，95℃变性15 s，60℃退火60 s，72℃延伸30 s，共循环40次。miR-187以U6为内参，采用2-ΔΔCt法计算miR-187相对表达量。

1.2.6MTT检测细胞增殖 收集转染后各组破骨细胞，接种于96孔板，分别培养24 h、48 h、72 h时每孔加入20 μl MTT溶液，置于培养箱内培养4 h，弃上清，每孔加入150 μl二甲基亚砜(DMSO)，匀速振荡10 min，应用酶标仪检测各孔在波长为490 nm处的相对吸光度值(OD)。

1.2.7流式细胞术检测细胞凋亡 收集各组破骨细胞，0.25%胰酶消化，加入含10%FBS的DMEM培养基制备细胞悬液，调整细胞浓度为1×108个/L，预冷PBS洗涤，加入10 μl浓度为20 mg/L的Annexin V-FITC与5 μl浓度为50 mg/L的PI，室温避光孵育30 min，置于FACS Calibur流式细胞仪及应用Cellauest软件检测各组细胞凋亡。

1.2.8Western印迹检测CyclinD1、p21、Bcl-2、Bax及Notch信号通路相关蛋白表达 收集各组破骨细胞，加入RIPA蛋白裂解液裂解细胞，4℃条件下经1 000 r/min转速离心15 min，取上层清液(蛋白)，采用二喹啉甲酸(BCA)法测定蛋白浓度，十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)90 min分离蛋白，转膜，封闭，分别加入CyclinD1、p21、Bcl-2、Bax、Notch1、Jagged1、DLL3、Notch2一抗，4℃条件下孵育24 h，TBST洗膜，二抗稀释液孵育1 h，置于自动凝胶成像系统分析各蛋白条带灰度值。

1.3统计学处理 采用SPSS21.0软件进行t检验，单因素方差分析、Pearson分析；采用受试者工作特征(ROC)曲线分析血清miR-187对骨质疏松性骨折的诊断价值。

2 结 果

2.1两组BMD对比 实验组BMD为(0.56±0.03)g/cm2，对照组BMD为(0.78±0.12)g/cm2，实验组与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。

2.2两组血清miR-187相对表达量比较 实验组血清miR-187相对表达量明显低于对照组(1.46±0.51 vs 2.20±0.69;P<0.001)。

2.3血清miR-187与BMD的相关性 骨质疏松性骨折患者血清miR-187与BMD呈正相关(r=0.357，P<0.05)，见图1。

图1 血清miR-187与BMD的相关性

2.4血清miR-187对骨质疏松性骨折的临床预测价值 如图2所示，血清miR-187用于预测骨质疏松性骨折的ROC曲线下面积(AUC)为0.856，95%CI为0.786～0.926，最佳界值为0.583，敏感度为0.700，特异度为0.883。

图2 血清miR-187预测骨质疏松性骨折的ROC曲线

2.5miR-187过表达对破骨细胞增殖的影响 48、72 h时miR-187组破骨细胞的相对吸光度值较NC组、miR-con组显著降低(P<0.05)，miR-187组CyclinD1 表达量较NC组、miR-con组显著降低(P<0.05)，p21蛋白相对表达量较NC组、miR-con组显著增加(P<0.05)。表明miR-187过表达可抑制破骨细胞增殖。见表2、图3。

图3 miR-187过表达对破骨细胞增相关蛋白表达的影响

2.6miR-187过表达对破骨细胞凋亡的影响 miR-187组破骨细胞凋亡率较NC组、miR-con组显著增加(P<0.05)，miR-187组Bax表达量较NC组、miR-con组显著增加(P<0.05)，Bcl-2 表达量较NC组、miR-con组显著降低(P<0.05)，表明miR-187过表达可促进破骨细胞凋亡。见表2、图4、图5。

图4 miR-187过表达对破骨细胞凋亡的影响

图5 miR-187过表达对破骨细胞凋亡相关蛋白表达的影响

2.7miR-187过表达对破骨细胞Notch信号通路的影响 miR-187组Notch1、Jagged1、DLL3表达量较NC组、miR-con组显著增加(P<0.05)；Notch2 表达量较NC组、miR-con组显著降低(P<0.05)，表明miR-187过表达可激活Notch信号通路。见图6、表3。

图6 miR-187过表达对破骨细胞Notch信号通路相关蛋白表达的影响

表3 miR-187过表达对破骨细胞Notch信号通路相关蛋白表达的影响

3 讨 论

骨吸收量高于骨形成是骨质疏松发生的根本原因，近年来，研究表明miRNA在成骨细胞或破骨细胞活性及分化过程中发挥重要作用〔11〕。miR-187-3p过表达可抑制IL-1β等炎症因子的释放从而减轻小鼠脊髓缺血再灌注引起的疼痛超敏反应〔12〕。研究表明miR-187表达下调可促进氧化应激诱导的视网膜细胞凋亡〔13〕。相关报道指出miR-187表达下调可促进牛皮癣中角质形成细胞增殖〔14〕。本研究结果说明随着骨质疏松性骨折患者BMD或骨代谢能力的降低，miR-187的表达水平显著降低。提示miR-187表达水平降低可能促进骨质疏松的发生及发展。本研究ROC曲线分析提示血清miR-187可能作为临床诊断骨质疏松患者是否发生骨折的生物学指标。但miR-187在骨质疏松性骨折发生过程中的调控机制尚未阐明。研究表明破骨细胞由多个单核细胞融合生成，细胞凋亡、细胞周期在破骨细胞分化过程中发挥重要作用，CyclinD1与p21是调控细胞周期的重要基因，p21可抑制细胞周期停滞于G0/G1期，CyclinD1可促进细胞周期由G1期进展为S期，促进细胞增殖〔15〕。本研究显示miR-187过表达后破骨细胞增殖能力显著降低，提示miR-187过表达可能通过促使细胞周期停滞于G0/G1期从而抑制细胞增殖。相关报道指出破骨细胞凋亡与Bcl-2、Bax基因表达密切相关，Bcl-2可抑制细胞凋亡，Bax可促进细胞凋亡，Bax表达水平升高可拮抗Bcl-2对细胞凋亡的抑制作用〔16〕。本研究结果显示miR-187过表达后破骨细胞凋亡率显著升高，提示miR-187过表达可通过上调Bax的表达及下调Bcl-2的表达从而诱导破骨细胞凋亡。

Notch信号通路激活后可促进成骨细胞分化及抑制破骨细胞增殖活性从而防止骨质疏松的发生〔17〕。Notch1是Notch信号通路中重要蛋白，研究表明Notch1的表达水平升高可促进Jagged1、DLL3的表达量升高，同时破骨细胞形成数量明显减少〔18〕。相关报道指出Notch信号通路由4个受体与5个配体组成，其中Notch2、Notch1、Jagged1、DLL3在人类间充质干细胞分化过程中发挥重要作用，同时Notch2表达量与破骨细胞增殖能力呈正相关，而Notch1、Jagged1、DLL3表达量与破骨细胞增殖能力呈负相关〔19，20〕。本研究结果提示miR-187可能通过增强Notch1信号通路同时抑制Notch2信号通路从而抑制破骨细胞增殖、分化，促进细胞凋亡。综上所述，miR-187可抑制破骨细胞增殖，促进破骨细胞凋亡，其作用机制可能是通过激活Notch1信号通路，抑制Notch2信号通路从而抑制破骨细胞增殖分化，诱导破骨细胞凋亡，减少破骨细胞存活，可为揭示骨质疏松的发病机制奠定理论基础，可为骨质疏松的治疗提供新方向。