半乳糖凝集素3在心房颤动中主要来源及作用机制

谢建 梁珊珊 宋波 秦忠心 彭俊秋 王冰 赵大奎

(湖北医药学院附属随州医院，湖北 随州 441300)

心房颤动(简称房颤)是临床最常见的心律失常，房颤易导致心力衰竭、心肌梗死等并发症〔1〕，给家庭和社会带来严重的负担，因此阐明房颤的发生发展机制对房颤的预防和治疗有十分重要的意义。心房纤维化被认为是房颤发生与维持的关键因素〔2〕。心房纤维化主要是心肌细胞外基质重构。多种炎症细胞及炎症因子参与了心肌细胞外基质重构〔3〕。辅助性T淋巴细胞(Th)17是近年来新发现的一种由Th0细胞在转化生长因子(TGF)-β1、白细胞介素(IL)-6、IL-23 和IL-21的刺激下分化而成的CD4+T细胞亚群，主要分泌IL-17发挥促炎作用〔4〕，在自身免疫性疾病和机体防御反应中具有重要意义〔5〕，而干扰素(IFN)、IL-4、细胞因子信号传送阻抑蛋白3则抑制Th0细胞分化为Th17细胞〔6〕。Th17细胞在自身免疫中起重要作用，目前证实Th17辅助细胞主要执行的细胞因子如IL-1、IL-6及IFN等在心力衰竭、病毒性心肌炎、动脉粥样硬化等多种疾病中发挥重要调节作用〔7，8〕。半乳糖凝集素(Gal)-3是与乙酰-乳糖胺的糖蛋白特异性结合的凝集素家族成员之一，表达于多种细胞，如内皮和上皮细胞、活化巨噬细胞、小胶质细胞、嗜碱性细胞、肥大细胞、中性粒细胞、神经元和心肌细胞等〔9〕。有研究显示高水平的Gal-3与心脏组织中浸润巨噬细胞的数量和细胞外基质的沉积呈正相关，Gal-3为心肌纤维化的生物标志物〔10〕。在急性心肌梗死早期，Gal-3促炎、促纤维化作用在心肌组织修复中发挥重要作用〔11〕。然而，持续的高水平Gal-3可诱导炎症和纤维化的过度激活，导致急性心肌梗死预后很差〔12〕。房颤是最常见的心律失常，免疫细胞浸润导致心肌组织的炎症反应与房颤发生相关，炎症介质可改变心房电生理从而增加房颤的易感性，炎症还可调节钙稳态蛋白和连接蛋白，这些均为干扰心房电传导的房颤触发因素〔13〕。然而，目前关于Gal-3在房颤中的作用及其主要来源尚未明确。本研究拟探究Gal-3在房颤动物模型中的表达及分泌来源和作用机制，从而为房颤治疗提供新的靶点。

1 材料与方法

1.1实验材料 实验SD大鼠购自上海斯莱克生物有限公司、TGF-β1抗体(货号3711)、平滑肌肌动蛋白(α-SMA)抗体(货号14968)、基质金属蛋白酶(MMP)-9抗体(货号3852)均购自CST公司；PE-抗大鼠CD3 单抗(货号A14811)APC-标记抗大鼠 CD4 单抗(货号A23523)、Gal-3单克隆抗体(货号p10212)均购自R&D公司；大鼠Gal-3酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒(货号YHS3135)购自上海煊翎生物有限公司；Masson染色试剂盒购自上海碧云天生物有限公司；引物均由上海杰李生物有限公司合成。一步法反转试剂盒(货号p434821)和荧光染料(货号P004392)购自Thermo。

1.2构建SD大鼠房颤模型 按随机数字表法将60只雄性SD大鼠(体重250～300 g)分为对照组(20只)、房颤组(20只)和房颤干预组(20只)。实验时3组大鼠均用1%戊巴比妥钠腹腔麻醉并气管插管，连接心电监护。房颤组用食道电极经口送入食管比邻心房处，电极连接电生理仪，设置电生理仪参数(电压20 V，电流4 mA，脉宽6 ms)，通过电生理仪发放脉冲波快速起搏心房。每次刺激30 s，间隔5 min待恢复窦性心律再次刺激，5次/d，通过心电监护确认房颤发作以证明模型构建成功。记录心脏心电图的详细情况，房颤的发生时间以P波消失并出现典型房颤波为标志，以恢复窦性心律作为房颤的终止，期间即为SD大鼠造模后房颤的持续时间。房颤干预组除上述处理外每48 h经腹腔注射Gal-3单克隆抗体100 μg，详细记录心电图。对照组仅在麻醉后气管插管和心电监护，不进行食道心房刺激。

1.3SD大鼠标本采集 ①血液标本收集：在实验开始前、实验第5天和第10天经鼠尾静脉取血50 μl，立即注入乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管并充分摇匀，2 000 r/min离心20 min后分离血浆，并将血浆分装于-80℃低温冰箱保存。②组织标本收集：于实验第10天将大鼠用1%戊巴比妥钠腹腔深度麻醉后将大鼠前胸壁打开，快速取出心脏，置于生理盐水中去除血液，取50 mg左右心房组织于4%多聚甲醛容器内保存，剩余心房组织置于-80℃冰箱保存。

1.4检测血浆Gal-3水平 用大鼠Gal-3 ELISA试剂盒检测大鼠血浆Gal-3蛋白水平。所有血浆样品检测重复进行，以确保变异系数(CV)低于10%，具体操作步骤根据ELISA试剂盒说明书进行。

1.5RT-PCR检测组织标本中Gal-3的表达 Trizol提取总 RNA，琼脂糖电泳检测其完整性，分光光度计测其纯度和浓度。按照试剂盒的说明进行RT-PCR，检测心肌组织中Gal-3 的表达情况。以 β-actin 为内参照，分析基因的相对表达量。Gal-3：正向引物序列 5′-TCGTAACGTACCAGACG-3′，反向引物序列 5′-CCGTGTACAGTCATGG-3′；β-actin：正向引物序列5′-ACTGATCGCCACCGCAG-3′，反向引物序列5′-ACCACAGTGTGCCGATCTGG-3′。

1.6流式细胞术分选心房组织中浸润的淋巴细胞 取病变区的心肌组织，眼科剪刀剪碎，用胰酶和胶原酶反复消化，待组织彻底裂解为单个细胞后，用400目的尼龙网去掉上清液中的团块，再用红细胞裂解液去除红细胞，用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤后制成单细胞悬液。所得细胞以 PMA 50 ng/ml，离子霉素1 μg/ml刺激，同时加入蛋白转运抑制剂莫能霉素1 μg/ml，置于37℃、5 %CO2培养4 h。收集细胞后依次进行表面抗原染色(PE-抗大鼠CD3单抗和APC-标记抗大鼠CD4单抗，流式细胞仪上应用活细胞分选术分选CD4+细胞和CD3+的其他成熟T淋巴细胞，运用流式软件FlowJo VX10统计辅助T淋巴细胞占所有成熟T淋巴细胞的比例。将流式分选后的CD3+/CD4+细胞和CD3+/CD4-的其他成熟T淋巴细胞收集并培养，校准细胞数量后，培养24 h后ELISA试剂盒检测上清中Gal-3蛋白的水平。

1.7心房颤动参数 SD大鼠离体心脏的心尖和右心房处分别连接电极，利用Langendorff 离体心脏灌流系统灌注离体SD大鼠心脏，同时生物电测量。生物电刺激由固定在心房壁上面的电极发放，每8个S1刺激后给予一个S2刺激，并且不断缩短S1、S2刺激间期的间隔，最终S2刺激会落在1个S1刺激的心房肌有效不应期内，从而S2刺激不能产生心跳，这个时间间隔即心房肌有效不应期。检测3组心房肌有效不应期，同时统计3组动作电位时程。

1.8Masson染色 心脏组织切片经二甲苯及不同浓度酒精水化至蒸馏水，Masson染色液中染1 h，苏木素染20 min，自来水洗，0.5%盐酸酒精分化30 s，丽春红-品红液染色10 min，充分水洗，脱水、透明、封片，运用Image软件分析心肌纤维化水平。

1.9Western印迹 用RIPA裂解心脏组织，组织破碎仪震荡，12 000 r/min离心20 min，去上清进行蛋白浓度测定，再用6×上样缓冲液制样。上样90 V恒压电泳，然后以400 mA恒流将蛋白转到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，用含5%脱脂奶粉的TBST溶液封闭PVDF膜1 h。封闭结束后，在含5%牛血清白蛋白(BSA)的TBST中的抗体4℃过夜，二抗室温结合2 h，加入显影液曝光显影，每组复孔3次。封闭结束后，根据目标蛋白条带所在位置剪切条带，将对应条带分别在含有0.1%的TGF-β1抗体、α-SMA抗体、MMP-9抗体、tubulin抗体的TBST溶液中4℃敷育过夜，然后在TBST溶液中洗膜，在对应二抗溶液中室温敷育2 h，TBST洗膜后加入显影液曝光显影。

1.10统计学方法 采用GraphPad Prism6.0软件进行方差分析及t检验。

2 结 果

2.1两组Gal-3水平比较 房颤组血浆中Gal-3水平〔(4.23±0.31)ng/L〕显著高于对照组〔(1.27±0.19)ng/L,P<0.05〕；房颤组心房组织中Gal-3 mRNA水平(5.46±0.78)显著高于对照组(1.04±0.08，P<0.05)。

2.2两组CD3+/CD4+占成熟T淋巴细胞的比例比较 房颤组CD3+/CD4+占成熟T淋巴细胞的比例〔(50.12±4.56)%〕显著高于对照组〔(13.27±1.73)%,P=0.007〕。见图1。

2.3两组T淋巴细胞亚群中Gal-3水平比较 对照组CD3+/CD4-的成熟T淋巴细胞上清中Gal-3水平〔(0.11±0.03)ng/L〕显著低于房颤组〔(0.19±0.06)ng/L,P<0.05〕;对照组CD3+/CD4+的成熟T淋巴细胞上清中Gal-3水平〔(0.21±0.03)ng/L〕显著低于房颤组〔(0.39±0.04)ng/L，P<0.05〕；且两组CD3+/CD4+的成熟T淋巴细胞上清中Gal-3水平显著高于CD3+/CD4-的成熟T淋巴细胞上清中Gal-3水平(均P<0.05)。表明房颤时血清中高水平的Gal-3主要来源于CD3+/CD4+细胞。

2.43组心电图基本参数比较 对照组无房颤发生；在刺激期房颤组均发生房颤，表明房颤模型构建成功；房颤干预组仅16只发生房颤，房颤发生率80%。房颤组平均心率、房性期前收缩个数、房性二联律个数、房性三联律个数、房颤持续时间均显著高于对照组，而给予Gal-3抗体干预后上述指标均显著降低(均P<0.05)。见表1。

2.53组心房不应期和动作电位时程水平比较 房颤组心房不应期及动作电位时程均显著低于对照组，而给予Gal-3抗体干预后上述指标均显著升高(均P<0.05)。见表2。

表2 3组心房不应期和动作电位时程比较

2.63组心房组织间质纤维化 房颤组心房组织间质纤维化水平〔(4.08±0.59)%〕显著高于对照组〔(1.02±0.05)%〕，而给予Gal-3抗体干预后心房组织间质纤维化水平显著降低〔(2.12±0.17)%,P<0.05〕。见图2。

图2 3组心房组织间质纤维化(Masson,×200)

2.73组心房组织纤维化相关蛋白水平比较 房颤组TGF-β1、α-SMA、MMP-9水平均显著高于对照组，而给予Gal-3抗体干预后上述指标均显著降低(P<0.05)。见图3，表3。

图3 3组组织纤维化相关蛋白水平

表3 3组心房组织纤维化相关蛋白水平比较

3 讨 论

Gal-3可通过促进中性粒细胞和单核细胞活化，诱导肥大细胞炎症介质释放及促进中性粒细胞和层黏连蛋白及内皮细胞的黏附促进炎症反应，Gal-3可促进T细胞的激活和刺激上皮细胞、内皮细胞、成纤维细胞产生多种细胞因子如IL-6、IL-8、粒细胞-巨噬细胞刺激因子和化学增活素及细胞黏附分子(CAM)-1，从而导致炎症的产生〔14〕。Gal-3是T细胞诱导炎症反应的早期启动因子，可通过促进释放前炎性细胞因子来放大炎症反应，并参与了心房纤维化〔15〕。

研究发现相对于健康志愿者，心力衰竭患者Gal-3、IFN-γ、IL-17A和TGF-β水平升高，并与临床严重程度相关，Gal-3是一种高特异性的诊断心力衰竭和判断临床严重程度的生物标志物〔16，17〕。研究表明高水平的Gal-3与心力衰竭患者的死亡率有显著的相关性〔18〕，房颤是心房电重构的结果，而心肌纤维化是导致心房电重构、心脏电活动的发生和传导异常，促进房颤发生的重要原因〔19，20〕。本研究结果提示抗炎治疗可能是房颤的治疗途径之一。

初始CD4+T 细胞接受抗原刺激后，在不同的条件下可分化成不同亚型的T细胞，执行不同的功能。其分化方向受抗原的性质、局部环境中的激素及细胞因子等多种因素调控〔21〕，其中细胞因子的种类和细胞因子之间的平衡对T淋巴细胞的分化有重要的调节作用〔22〕。许多转录因子如Foxp3可特异性调控Th17细胞的活化〔23，24〕，因此通过调控转录因子的表达及加入炎症因子中和抗体抑制T 细胞的增殖活化，是改善房颤的重要途径。

研究发现CD4+CD25+调节T细胞能抑制T淋巴细胞产生IL-2和IFN-γ，明显促进TGF-β的产生〔25〕，当加入抗TGF-β 中和性抗体时，可抑制心房组织纤维化的发生〔26〕。本研究结果表明，加入抗Gal-3中和性抗体可显著改善心房组织纤维化。

综上，大鼠房颤模型中心房组织的Gal-3基因水平和蛋白质水平均显著升高，且Th17是房颤时高水平Gal-3的主要来源，Gal-3与房颤时炎症和纤维化的发生相关。Gal-3是一种有强大的招募中性粒细胞的前炎性细胞因子，能促进多种细胞释放炎性因子，在心房组织重塑及心房间质纤维化过程中发挥重要作用，是调节房颤发生的重要靶点。