上调乳腺癌细胞MCF-7中IGFBP-6基因对细胞增殖的影响

薛晶 程玉 陈永良 严晓丽 严鹏 申兴斌

(承德医学院 1形态实验中心，河北 承德 067000；2附属医院)

乳腺癌是世界范围内女性最常见的恶性肿瘤之一，也是导致女性死亡的重要因素，近年来其发病率及死亡率有逐年上升的趋势〔1～4〕。对于乳腺癌的治疗，早期手术切除效果较好，但是如已发生转移，手术效果会大打折扣，因此寻找治疗乳腺癌的有效靶点已迫在眉睫。胰岛素样生长因子(IGF)家族调控细胞增殖、分化、凋亡及癌变，这些不同的生物活性主要通过IGF与受体Ⅰ型和Ⅱ型(IGF-ⅠR和IGF-ⅡR)的结合介导。流行病学研究表明，胰岛素样生长因子结合蛋白家族(IGFBPs)与几种常见癌症的风险增加有关〔5〕。IGFBP-6通过特异性结合IGF-Ⅱ抑制细胞增殖〔3〕。基因芯片研究也表明IGFBP-6在癌症中具有抗增殖作用〔7〕。IGFBP-6对乳腺癌的作用尚无报道，因此本文主要探讨IGFBP-6对乳腺癌组织及细胞的影响。

1 材料与方法

1.1材料 收集2017年4月至2018年2月承德医学院附属医院病理科乳腺癌手术切除石蜡标本80例及癌旁组织标本50例，术前告知患者并与家属签署知情同意书。患者术前均未接受过任何形式的放化疗治疗。

细胞系及主要试剂：人乳腺癌细胞MCF-7购自北京北纳创联生物技术研究院，DMEM培养基、胰酶购自美国Gibco公司，优级胎牛血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司，IGFBP-6质粒购自苏州吉玛基因股份有限公司，IGFBP-6抗体购自英国Abcam公司(1∶100稀释)、二氨基联苯胺(DAB)显色剂购自福建迈新生物技术开发有限公司，实验所需无水乙醇、二甲苯均为分析纯，均由承德医学院病理学与病理生理学重点学科实验室提供，Trizol试剂购自Invitrogen公司，IGFBP-6基因和β-actin 均由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

主要仪器：二氧化碳培养箱(美国Thermo公司)，超净工作台(上海新苗医疗器械制造有限公司)，倒置相差显微镜(德国Leica公司)，全自动酶标仪ELX808(美国伯腾仪器有限公司)。

1.2免疫组织化学法检测乳腺组织中IGFBP-6的表达 采用免疫组化Maxvision法检测乳腺癌及癌旁乳腺组织中IGFBP-6的表达，根据步骤依次进行，加一抗(稀释1∶100)，二抗，DAB显色。结果根据Volm双评分法判定。

1.3细胞培养及转染 乳腺癌细胞MCF-7用含10%胎牛血清的DMEM完全培养基，放置于37℃，5%CO2恒温培养箱，细胞每2～3 d传代一次，取对数生长期细胞用于后续实验。取对数生长期的细胞，胰酶消化，调整细胞密度为1×105个/ml，接种到6孔板中，每孔加2 ml细胞悬液，细胞分为实验组和空白对照组，实验组转染IGFBP-6。操作步骤按照Transemate试剂盒说明书进行。

1.4MTT法检测上调IGFBP-6对乳腺癌细胞增殖的影响 将实验组和空白对照组细胞接种与96孔板，每孔接种细胞1×104个，每组设6个复孔，37℃培养24 h后实验组转染，培养24、48、72 h后，每孔加10 μl MTT溶液(5 mg/ml)，继续培养4 h，终止培养，弃掉培养基，每孔加入15 μl二甲基亚砜(DMSO)，酶标仪上震动10 min，测定波长在490 nm处各孔细胞的光密度(OD)值。

1.5qRT-PCR法检测IGFBP-6 mRNA的表达 转染后36 h收集细胞，按照Trizol说明书提取总RNA，评价RNA纯度，根据天跟FastQuant 试剂盒说明书合成cDNA第一链。PCR所用引物由上海生工设计，引物序列：H-GAPDH正义链为5′-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3′，H-GAPDH反义链为5′-TGGTGAAGACGACAGTGGA-3′；IGFBP-6正义链为5′-AGGAATCCAGGCACCTCTACCAV-3′，IGFBP-6反义链为5′-AGCACTGAGTCCAGATGTCTACGG-3′，将PCR体系加入8联排，反应条件参照说明书在CFX96定量PCR仪中运行，实验重复3次。转染48 h后取所有组别的细胞，提取RNA，采用荧光定量PCR检测转染后RNA相对表达量，ΔΔCt为mRNA的相对表达量，ΔΔCt=实验组〔Ct(IGFBP-6)-Ct(GAPDH)〕-空白对照组〔Ct(IGFBP-6)-Ct(GAPDH)〕。

1.6Rt-PCR法检测乳腺癌组织中IGFBP-6 mRNA的表达 采用TRIzol一步法对组织提取RNA，所用组织为乳腺癌及癌旁乳腺组织，所用引物为IGFBP-6和GAPDH。取扩增产物行2%琼脂糖凝胶电泳，EB染色跑胶20 min后在紫外荧光数字成像仪下摄像，进行定量分析，以IGFBP-6与相应GAPDH扩增产物条带累积吸光度的比值作为IGFBP-6 mRNA的相对表达量。

1.7统计学方法 采用SPSS19.0软件进行秩和检验、两独立样本t检验和方差分析。

2 结 果

2.1乳腺癌及癌旁组织中IGFBP-6的表达 IGFBP-6主要表达于癌旁乳腺组织及乳腺癌细胞质中，呈棕黄色颗粒状，着色不一。在乳腺癌标本80例中，IGFBP-6表达阴性18例(22.50%)，弱阳性55例(68.75%)，中度阳性6例(7.50%)，强阳性1例(1.25%)；癌旁组织50例中，IGFBP-6表达阴性1例(2.0%)，弱阳性7例(14.0%)，中度阳性13例(26.0%)，强阳性29例(58.0%)。可以看出乳腺癌中IGFBP-6表达阳性率及染色强度较癌旁组织显著降低(P<0.05)，推断IGFBP-6在乳腺癌中低表达。见图1。

图1 IGFBP-6癌旁组织及乳腺癌组织中的表达(Maxvision法，×40)

2.2上调IGFBP-6抑制乳腺癌细胞MCF-7的增殖能力 转染24 h、48 h后，MTT法检测显示实验组的细胞增殖活性均显著低于空白对照组(P<0.05)。见表1。

2.3转染后MCF-7细胞IGFBP-6的表达 实验组IGFBP-6表达明显高于空白对照组(P<0.05)。见表1。

2.4乳腺癌组织及癌旁组织IGFBP-6 mRNA表达比较 乳腺癌组织IGFBP-6 mRNA表达明显低于癌旁正常组织(0.44±0.04 vs 0.83±0.08,P<0.05)。

3 讨 论

乳腺癌治疗以手术为主要方法，并结合放化疗,内分泌治疗等综合治疗方法，但乳腺癌生物行为有待研究，治疗效果欠佳，预后难料〔8〕。这可能与乳腺癌的生物学异质性有关。近年来肿瘤的生物学治疗得到越来越多的关注，乳腺癌靶向治疗成为临床研究热点，其治疗效果也得到显著提高〔9〕。因此，需要新的预后标志物和治疗靶点来指导和改进乳腺癌患者的治疗方法。

对IGF轴进行异常刺激可以导致癌症的发展和进展〔10〕。研究表明与非肿瘤组织相比，胃腺癌组织中IGFBP-6的表达降低，且分化程度越低，IGFBP-6表达越低〔11〕；一项体外研究表明IGFBP6是鼻咽癌的抑癌因子，IGFBP-6阳性表达与降低局部复发和远处转移风险有关。Cox模型的多因素分析表明IGFBP-6是鼻咽癌局部复发和远处转移的独立预后生物标志物〔12,13〕。

本研究通过免疫组织化学及RT-PCR法研究发现IGFBP-6蛋白及mRNA在乳腺癌组织中表达明显低于癌旁正常组织，细胞中研究表明在乳腺癌细胞MCF-7中转染IGFBP-6后可明显抑制细胞增殖，本研究结果与Kaulsay等〔14〕结果一致，与良性乳腺肿瘤患者的血清相比，乳腺癌患者血清IGFBP-6浓度较低。

Xu等〔15〕发现IGFBP-6和趋化因子(C-C motif)配体(CCL)18是前列腺癌新的血清生物标志物。二乙基己烯雌酚处理后IGFBP-6水平升高，重组IGFBP-6对细胞增殖起抑制作用〔16〕。这些发现可提示IGFBP-6可能作为多种肿瘤的标志物〔17〕。本实验通过对不同的乳腺癌细胞株进行转染，转染后的细胞降低了细胞的增殖率。表明IGFBP-6对乳腺癌的增殖起到抑制作用，但其主要机制还在进一步研究中，具体主要从两个方面：一，抑制血管生成；二促进凋亡的发生。

本研究结果表明IGFBP6可能作为一种新的乳腺癌预后标志物。在临床治疗中起到一定的指导作用。