针刺与脑组织腺苷水平的相关性

吴九如 刘子萱 刘新宇 张崇恒 曲姝妍 胡英华

(1长春中医药大学针灸推拿学院，吉林 长春 130117；2香港浸会大学)

治疗失眠的药物存在成瘾性、耐受性及宿醉感等相关不良反应〔1，2〕，故开发出更具疗效且不良反应少的治疗手段成为该领域的研究重点。针灸以激活内源性物质为治疗手段，对人体伤害小、可行性高、无副作用，是目前较安全的一种治疗手段，在临床实践中有明显的治疗效果。中医学认为失眠的病因大致分为饮食不节、情志失常、劳逸失调和病后体虚等几类，现代医家治疗失眠是以古代先贤医家的理论为基础，进行衍化发展，可分别从五脏、六腑、脑、营卫、痰热、血瘀论治〔3～7〕。尽管各个医家看失眠的角度不同，论治的方法不同，失眠证型各有不同，然总的病机变化归属于阳盛阴衰，阴阳失交。基于这一病机，本研究选择针刺治疗，针刺的治疗原则主要以交通阴阳，宁心安神为主。

研究发现，腺苷作为存在于所有细胞中的天然嘌呤核苷〔8〕，它不仅是神经细胞的代谢产物，而且在中枢神经系统中发挥着重要作用，是一种强效的内源性睡眠因子，通过抑制下丘脑组胺能神经元的神经传递、激活γ-氨基丁酸神经元、抑制腺苷受体A1、A2a发挥促进睡眠的作用，可显著影响睡眠-觉醒规律〔9～13〕。本课题主要探讨针刺睡眠相关穴位对大鼠脑组织中腺苷水平的影响及针刺后腺苷在脑组织中的动力学规律。

1 材料与方法

1.1实验仪器 PF-53原子荧光分光光度计，普析通用仪器有限责任公司；FA1004B型电子天平，上海佑科仪器仪表有限公司；高效液相色谱仪，美国Agilent公司；C18高效液相色谱柱，江苏汉邦科技有限公司；针式滤器，海兴亚净化科技材料；SK-1型快速混匀器，可调微量移液器北京维欣仪奥科技发展有限公司；梅特勒AB135-S电子分析天平，特勒-托利多；Sigma台式高速冷冻离心机3K15，德国Sigma公司。

1.2试剂与药品 艾司唑仑1 mg(H37023047)，山东信谊制药有限公司；盐酸优级纯(GR)500 ml(1512071)，西陇化工股份有限公司；硼氢化钾分析纯(AR)100 g(Q/12HG4890-2007)，天津市化学试剂研究所；氢氧化钠 AR 500 g(20110118)，北京化工厂；硝酸GR 500 ml(20150508)，北京化工厂 ；高氯酸 AR 500 ml(2014112)，天津市鑫源化工有限公司；腺苷标准品20 mg (110879200202)，中国食品药品检定研究院；柠檬酸钠 AR 500 g(20080708)，北京化工厂；磷酸氢二钾 AR 500 g(1504021)，西陇化工股份有限公司；甲醇色谱纯 500 ml(20151117143)，山东禹王实业有限公司；娃哈哈纯净水 596 ml(201601181214)，杭州娃哈哈饮料有限公司；磷酸二氢钾 AR 500 g(140110)，北京化工厂。

1.3动物分组 考虑到针刺的镇静催眠作用可能出现性别差异，所以每组都设计了性别差异对照。将600只SD大鼠(雌雄各半)随机分为12组，每组50只，雌雄各半。第1组为空白组，不接受针刺；第2组为阴性对照组，针刺与睡眠无关的穴位；第3组为艾司唑仑组；第4组至第7组依次为百会、印堂、内关、三阴交单穴位针刺组；第8组为百会+印堂组合针刺组，第9组为内关+三阴交组合针刺组；第10组为百会+印堂+三阴交组合针刺组；第11组为印堂+内关+三阴交组合针刺组；第12组为百会+印堂+内关+三阴交组合针刺组。以针刺入穴位时开始计时，于0.5 h、1.0 h、1.5 h、2.0 h、2.5 h按照雌雄各半随机取样，分析脑组织中腺苷含量。

1.4实验方法 每组按照实验方案针刺刺激相关穴位，并留针20 min。以针刺入穴位时开始计时，按照取样时间点雌雄各半随机选出10只大鼠，进行断头处理，于冰浴中迅速取脑，称重，制备脑组织匀浆液，取经处理的脑组织匀浆上清液10 μl，注入高效液相色谱仪，测定腺苷含量。

1.4.1样品处理方法 A液的配制：①在50 ml烧杯中加入适量的娃哈哈纯净水并向其中加入21 ml高氯酸，搅拌均匀并使其冷却;②待其冷却后转移至100 ml容量瓶中并用娃哈哈纯净水定容至刻度。B液的配制：精密称定0.588 2 g柠檬酸钠、6.846 6 g磷酸氢二钾、0.074 5 g乙二胺四乙酸二钠用娃哈哈纯净水溶解后定容至100 ml。按1∶5(W∶V)比例加入冰冷的A液中研磨充分，涡旋震荡10 min，然后4℃，14 000 r/min，离心10 min。取上清，按A∶B=1∶3比例加入B液混合均匀，冰浴静置1 h，4℃，14 000 r/min，离心10 min。取上清1 ml，加入2 mol/L NaOH溶液200 μl调节pH近中性，取10 μl于高效液相色谱仪测定腺苷含量。

1.4.2色谱条件 ODS-2 C18汉邦色谱柱(250×4.6，5 μm)，流速1 ml/min。柱温32℃，流动相0.01 mol/L磷酸二氢钾∶甲醇=90∶10，测波长260 nm。

1.5统计学方法 采用SPSS18.0软件进行方差分析、t检验。

2 结 果

非催眠穴位针刺，空白组与阴性对照组小鼠脑组织中腺苷水平相近，均很低。接受百会、印堂、内关、三阴交单穴位针刺组小鼠脑组织中腺苷水平明显增高，同时间点4个穴位组之间差异无统计学意义(P>0.05)，而且各组的动态变化呈现几乎相同的规律：1.0 h的腺苷水平最高，0.5 h和1.5 h的腺苷水平位居第二，2.0 h的腺苷水平位居第三(P<0.01)，2.5 h的腺苷水平与阴性对照组和空白组差异无统计学意义(P>0.05)，可以发现，百会、印堂、内关、三阴交4个穴位在调节失眠的过程中会引起腺苷水平的变化，疗效作用时间下降较快，在2.5 h后基本消失，说明单一穴位存在时效性短的不足。百会+印堂组合针刺组和内关+三阴交组合针刺组与接受单穴位针刺组比较，小鼠脑组织中腺苷水平在各时间点均明显升高(P<0.01)，两个双穴位组之间各时间点比较差异无统计学意义(P>0.05)，而且各组的动态变化呈现几乎相同的规律：1.0 h和1.5 h的腺苷水平最高，0.5 h和2.0 h的腺苷水平位居第二， 2.5 h的腺苷水平与阴性对照组和空白组比较差异无统计学意义(P>0.05)，说明穴位配伍会提高针刺治疗失眠的腺苷水平，百会+印堂疗效明显高于内关+三阴交(P<0.01)，表面同功穴配伍的疗效相对显著。接受三穴位针刺的小鼠脑组织中腺苷水平较接受双穴位针刺的小鼠在各时间均有明显升高(P<0.01)。对于特定的时间点，2个三穴位组之间没有差异，而且各组的动态变化呈现几乎相同的规律：1.0 h和1.5 h的腺苷水平最高，0.5 h和2.0 h的腺苷水平位居第二，2.5 h的腺苷水平略高于阴性对照组和空白组和双穴位组。接受四穴位针刺的小鼠脑组织中腺苷水平较接受三穴位针刺的小鼠在各时间均有明显升高(P<0.01)，虽然动态变化规律与接受三穴位针刺的各组的动态变化几乎相同，但2.5 h的腺苷水平却高于三穴位针刺的各组，明显高于阴性对照组和空白组和双穴位组(P<0.01)。针刺刺激的睡眠相关穴位越多，大鼠脑组织中腺苷水就越高并且持续的时间也越长。同时刺激4个穴位的作用效果与艾司唑仑的作用效果几乎相同(P>0.05)，这与针灸临床实践的结果相吻合。无论是否收到外界刺激，雄性大鼠脑组织中的腺苷水平均高于雌性大鼠脑组织中的腺苷水平(P<0.01)，见表1，表2。

3 讨 论

睡眠是人体自身存在的一种保护屏障，是保持身心健康的根本。中医学强调人体与自然界为一个整体，而睡眠正是遵循了“日出而作，日落而息”的自然界规律。睡眠可以帮助人体恢复能量，能对人体的躯体经络和神经系统进行修复。人体的各组织器官，每天都处在高耗能的生理活动中，睡眠可以帮助修复、合成、补充人体生命活动中所需的营养物质，同时代谢掉机体内垃圾堆积，使人有足够的体力和精力。那么反之，失眠就会导致一系列的机体失衡，造成严重后果。

目前，临床上治疗失眠的主要手段还是依靠苯二氮卓类安眠药物，但该类药物具有一定的成瘾性和药物依赖性，长期治疗效果不明显，还会给患者造成巨大的身心压力。近几年来，随着人们生活水平及思想意识的提高，针灸以其便捷，安全，无副作用深受患者的欢迎和信任，越来越成为失眠患者的首选。失眠患者普遍存在着下丘脑-垂体-肾上腺皮质(HPA)系统过度激活，HPA轴的亢进导致神经过于兴奋，从而引起失眠〔14〕。腺苷是可以影响睡眠-觉醒规律的一种内源性物质。腺苷通过抑制神经元的活性，调节神经递质来改善睡眠觉醒过程。腺苷可以抑制下丘脑组胺能神经元的神经传递，延长大鼠的NREM睡眠；通过腹外侧视前区，激活γ-氨基丁酸神经元促进睡眠；通过腺苷受体(A1、A2a受体)抑制下丘脑神经元放电，促进睡眠〔15〕。而针刺穴位可以促进腺苷的分泌，通过穴位配伍增强其疗效，从而大脑中的兴奋性神经元和激活促眠神经元，达到促进睡眠的作用。

本文结果表明，针刺刺激与睡眠相关的穴位，可以产生类似于治疗失眠的药物的作用，即均可以提高大鼠脑组织中与睡眠相关内源性物质腺苷的水平。而且针刺刺激的睡眠相关穴位越多，在同一时间点脑组织中腺苷水平峰值就越高。由此可见，增加针刺刺激与睡眠相关的穴位的数量，与增加治疗失眠的药物的给药剂量有相似的作用。这无疑为例临床上针刺治疗失眠提供了药物动力学依据。针刺刺激的睡眠相关穴位越多，大鼠脑组织中的腺苷水平就越高，并且高于对照组腺苷水平持续的时间就越长，这为临床上的针刺治疗提供了定量的选择依据。虽然腺苷是通过刺激可以提高其在脑组织中水平的内源性物质，但是，这种有效的刺激部位不仅是有限的，而且是特定的。尽管腺苷是遍布全身的内源性物质，但是却不是任何穴位的刺激都可以提高其在脑组织中的水平，这表明：百会、印堂、内关、三阴交等穴位在与腺苷的信号通路中相关。腺苷在脑组织中水平的提高，可能来源于针刺刺激特定穴位导致的机体其他部分的腺苷向脑组织中的定向迁移，也可能来源于针刺刺激特定穴位导致的体内腺苷的迅速生成。