去卵巢小鼠焦虑样行为和血清激素水平及当归补血汤的干预作用

马微微 闫金铭 郭鑫睿 葛金环 王琪 魏薇 黄莉莉

(黑龙江中医药大学药学院，黑龙江 哈尔滨 150040)

焦虑在女性一般人群中的发病率约为男性的2倍，在围绝经期女性中，焦虑的发生率显著增加〔1，2〕。围绝经期伴随着负性情绪的增加，影响女性的身心健康。围绝经期卵巢功能衰退、体内雌激素水平下降，激素替代治疗可作为围绝经期改善情绪的主要治疗策略，但是存在增加子宫内膜癌、心脑血管疾病等风险的争议〔3〕。研究表明当归补血汤可以有效改善围绝经期女性的精神和躯体症状〔4～6〕，但是相关的实验研究较少。本实验主要观察去卵巢小鼠的焦虑样行为、血清激素水平的变化及当归补血汤的干预作用。

1 材料与方法

1.1实验动物 SPF级ICR雌性小鼠，体重(23±2)g，由黑龙江中医药大学实验动物中心提供，动物许可证号：SYXK(黑)2018-007。动物饲养于屏障环境动物室，实验期间自由饮水、摄食，室温：(20±3)℃；湿度为(55±15)%；照明：12 h明暗交替(光照：7∶00～19∶00，黑暗：19∶00～7∶00)。

1.2试剂及药物 当归购于哈尔滨益安堂大药房有限公司和平店，经药学院生药学教研室老师鉴定；黄芪购于哈尔滨益安堂大药房有限公司和平店，经药学院生药学教研室鉴定；水合氯醛购于天津市大茂化学试剂厂(批号：20190327)；小鼠雌二醇(E2)酶联免疫吸附试验试剂盒购于南京建成生物工程研究所(20191114)；小鼠皮质酮(CORT)酶联免疫吸附试验试剂盒购于南京建成生物工程研究所(20191114)。小鼠褪黑素(MT)酶联免疫吸附试验试剂盒购于南京建成生物工程研究所(20191114)。

1.3实验仪器 高压灭菌锅：上海博讯实业有限公司，型号：YXQ-SG46-280S；高架十字迷宫装置：黑龙江中医药大学中药药理实验室自制；高速低温冷冻离心机：美国TOMOS有限公司，型号：3-18R(3006004)；-80℃超低温冰箱：青岛海尔特种电器有限公司，型号：DW-86L338；酶标仪：美国Bio-Rad公司，型号：xMark10092；分析天平：美国NewClassic MF公司，型号：MS105。

1.4方法

1.4.1当归补血汤的制备 取黄芪90 g、当归18 g，加入8倍量水，浸泡1 h，小火煎煮20 min后过滤，滤渣加入4倍量水小火再煎煮20 min，过滤，合并两次滤液并浓缩至浓度为2 g/ml。将2 g/ml的当归补血汤水煎液分别稀释4倍、16倍，即得到当归补血汤低、中、高剂量组，浓度分别为0.125 g/ml、0.500 g/ml、2.000 g/ml。

1.4.2去卵巢手术、给药及分组 适应性饲养7 d后，60只小鼠随机分为假手术组，模型组和低、中、高剂量组。模型组和各剂量组按照文献方法〔7〕，摘除小鼠双侧卵巢。假手术组只摘除卵巢附近同样体积的脂肪组织。术后各组均连续注射青霉素3 d，以防感染。术后恢复7 d，低、中、高剂量组于每日早8∶00灌胃给药，剂量分别为2.5、10.0、40.0 g/kg；模型组、假手术组灌胃给予同体积蒸馏水，连续给药7 d。

1.4.3高架十字迷宫测试 各组均于末次给予蒸馏水或当归补血汤低、中、高剂量后20 min，进行高架十字迷宫测试。测试时间范围为早8∶30～12∶00。首先将小鼠背对实验者，头朝向开臂端放置在高架十字迷宫上，视频记录装置记录5 min内小鼠运动情况。每只实验动物做完实验后，高架十字迷宫开臂和闭臂都用75%酒精擦拭，待酒精挥发后，按照上述步骤，再继续放第2只小鼠，直至所有动物做完实验。观看视频，记录动物进入开臂次数和滞留时间，进入闭臂次数及滞留时间，计算开臂次数比例和滞留时间比例作为焦虑评定指标。开臂次数比例=开臂次数/(开臂次数+闭臂次数)×100%。开臂时间比例=开臂滞留时间/(开臂滞留时间+闭臂滞留时间)×100%。

1.4.4小鼠血清E2、皮质酮及MT含量检测 高架十字迷宫测试结束后立即将小鼠摘除眼球取血，血液静止1 h后经离心机5 000 r/min，离心10 min，取上清液，-80℃超低温冰箱保存，待测。采用酶联免疫吸附试验，测定小鼠血清中E2、CORT及MT含量，操作步骤按试剂盒说明书进行。

1.4.5小鼠子宫重量称量 各组小鼠取血后断椎处死，打开腹腔，分离子宫系膜并剥离周围脂肪，切断输卵管与子宫的连接，在子宫颈与子宫角的交界处切下子宫角，得到完整新鲜子宫，立即称量其湿重，计算子宫系数。子宫系数=子宫湿重/体重×100%

1.5统计学方法 采用SPSS17.0软件进行单因素方差分析及t检验。

2 结 果

2.1不同剂量当归补血汤对去卵巢小鼠高架十字迷宫中活动情况的影响 与假手术组相比，模型组小鼠处于高架十字迷宫中的开臂时间比例、开臂次数比例均明显降低(P<0.01)。见表1。

2.2不同剂量当归补血汤对去卵巢小鼠子宫系数的影响 与假手术组相比，模型组小鼠的子宫系数明显降低(P<0.01)。与模型组相比，低、中、高剂量组小鼠的子宫系数均明显升高(P<0.05)。见表1。

2.3不同剂量当归补血汤对去卵巢小鼠血清E2、CORT及MT水平的影响 与假手术组相比，模型组小鼠E2、MT含量明显降低，CORT含量明显升高(P<0.01)。与模型组相比，低、中、高剂量组小鼠E2、MT含量均明显升高、CORT含量均明显降低(P<0.01)。与模型组相比，低剂量组小鼠MT含量明显升高(P<0.05)；中、高剂量组小鼠MT含量均明显升高(P<0.01)。见表1。

3 讨 论

当归补血汤始载于《神农本草经》，由当归和黄芪两味中药组成，具有补血活血、调经止痛、润肠通便的功效。当归是中医药治疗焦虑症的一味常用中药〔8〕，现代药理研究表明，当归精油具有良好的抗焦虑作用〔9〕。本研究结果提示当归补血汤对去卵巢小鼠的抗焦虑作用，具有一定的剂量依赖性，大剂量才可表现出发挥其作用。

雌激素降低是围绝经期女性出现负性症状的主要原因，雌激素替代治疗可以缓解相应的负性症状。谭玄松〔10〕研究发现，当归补血汤可增加单侧切除卵巢大鼠的雌激素水平，延缓去势大鼠绝经后衰老。外源性给予E2，通过减少基础或应激状态下的CORT水平，表现出对去卵巢动物的抗焦虑作用，此作用仅限于一定的E2水平范围内〔11〕，为当归补血汤仅大剂量表现出抗焦虑作用提供了依据。本研究结果表明当归补血汤可能通过提高去卵巢小鼠体内的E2水平，降低CORT水平，从而改善去卵巢动物的焦虑情绪。

MT是松果体产生的一种胺类激素，具有显著的抗氧化应激作用，表现出延缓衰老的作用。绝经女性表现出夜间MT分减少〔12〕。研究证实MT可表现出激素替代治疗作用，减少围绝经期的氧化应激，进而缓解围绝经期负性症状〔13，14〕，而且MT还表现出抗焦虑作用〔15，16〕。当归补血汤可增加去卵巢小鼠MT含量，推测MT参与其改善去卵巢动物的焦虑情绪作用。