miR-188-5p靶向Nek6对宫颈癌细胞的影响及机制

许文丽 邢秀月 徐川微

(1海口市人民医院妇产科，海南 海口 570208；2琼海市人民医院妇科)

宫颈癌是临床常见的妇科疾病，其病死率较高且已严重威胁女性生命健康，目前宫颈癌的诊断及治疗取得一定进展，但患者预后不佳〔1〕。微小RNA(miRNA)是一类非编码单链RNA，宫颈癌中miRNA表达失调可能作为生物标志物或治疗靶点〔2～4〕。研究发现微小RNA-188-5p(miR-188-5p)在胃癌、急性髓细胞白血病中表达下调，并可在肿瘤发生发展过程中发挥抑癌基因作用〔5,6〕。但miR-188-5p对宫颈癌的影响尚未可知。TargetScan预测显示NIMA相关激酶(Nek)6可能是miR-188-5p的靶基因，研究表明Nek6在肿瘤中表达上调，并可能是恶性肿瘤的潜在治疗靶位点〔7〕。本研究旨在探讨miR-188-5p在宫颈癌细胞增殖、凋亡、迁移及侵袭中发挥的作用。

1 材料与方法

1.1材料与试剂 宫颈癌HeLa细胞购自上海信裕生物。Lipofectamine2000购自美国Invitrogen；si-Nek6、si-NC购自上海吉玛制药技术有限公司；miR-188-5p mimics、anti-miR-188-5p、miR-NC、anti-miR-NC购自广州锐博生物；反转录试剂盒、Trizol、SYBR Green试剂盒购自北京天根生化；pcDNA3.1购自上海远慕生物；细胞凋亡检测试剂盒购自美国Sigma；甲基噻唑基四唑(MTT)购自上海泽叶生物；Transwell小室购自美国Corning；兔抗人细胞周期蛋白(Cyclin)D1、B淋巴细胞瘤(Bcl)-2、Bcl-2相关X蛋白(Bax)抗体购自美国CST；二抗购自武汉艾美捷；兔抗人基质金属蛋白酶(MMP)-2、E-cadherin、P21抗体购自美国Santa Cruz；基质胶购自美国BD。收集2016年8月至2018年6月海口市人民医院收治的33例宫颈癌患者的癌组织及癌旁组织标本，年龄50～70岁，平均(65.85±5.57)岁。

1.2方法

1.2.1细胞转染及分组 HeLa细胞接种于24孔板，细胞70%时融合用Lipofectamine2000进行转染，根据转染物不同，实验分组：miR-NC组(将miR-NC转染HeLa细胞)、si-NC组(将si-NC转染HeLa细胞)、miR-188-5p组(将miR-188-5p mimics转染HeLa细胞)、si-Nek6组(将si-Nek6转至HeLa细胞)、miR-188-5p+pcDNA3.1组(将miR-188-5p mimics与pcDNA3.1共转染HeLa细胞)、miR-188-5p+pcDNA3.1-Nek6组(将miR-188-5p mimics与pcDNA3.1-Nek6共转染HeLa细胞)。

1.2.2qRT-PCR检测miR-188-5p的表达水平 Trizol法提取组织样本、各组宫颈癌细胞总RNA，以反转录合成cDNA为扩增模板进行qRT-PCR。用2-ΔΔCt法计算miR-188-5p相对表达量(内参为U6)。

1.2.3MTT检测细胞增殖 0.25%胰蛋白酶消化各组HeLa细胞，制备单细胞悬液，取150 μl接种于96孔板，每孔加入MTT溶液20 μl，继续培养4 h，弃上清，每孔加入150 μl二甲基亚砜(DMSO)，避光振荡溶解结晶。酶标仪分析各孔吸光度值。

1.2.4平板克隆形成实验 将各组HeLa细胞接种于12孔板，于培养箱培养，每3 d更换一次培养液，待细胞数高于50个即为一个集落，直至12孔板集落之间发生相互融合结束计数。

1.2.5流式细胞术检测细胞凋亡率 用500 μl的1×结合缓冲液重悬HeLa细胞，依照凋亡试剂盒说明书分析细胞凋亡情况。

1.2.6Transwell实验检测细胞迁移与侵袭 迁移实验：将宫颈癌HeLa细胞按照每孔200 μl的密度将细胞悬液加入小室的上室，含有10%胎牛血清的培养液加入下室600 μl，培养24 h后用多聚甲醛固定迁移细胞，用0.1%结晶紫染色，显微镜下计数迁移数。侵袭实验：先用预冷的培养液稀释基质胶，然后取Transwell小室包被基质胶，后续步骤同迁移测定。

1.2.7双荧光素酶报告基因检测 构建野生型载体WT-Nek6与突变型载体MUT-Nek6，将WT-Nek6与miR-NC、MUT-Nek6与miR-NC、WT-Nek6与miR-188-5p mimics、MUT-Nek6与miR-188-5p mimics共转染至HeLa细胞，转染24 h后收集细胞，测定相对荧光素酶活性。

1.2.8Western印迹检测Nek6、Bcl-2、MMP-2、P21、E-cadherin、Bax、CyclinD1蛋白表达 RIPA法提取细胞总蛋白，120 V SDS-PAGE分离90 min，200 mA转膜30 min。膜封闭后，用特异性一抗4℃孵育过夜，用二抗室温孵育1 h，滴加增强型化学发光试剂(ECL)显影，应用ImageJ软件分析各条带相对于GAPDH灰度值。

1.3统计学处理 采用SPSS21.0软件进行t检验、方差分析。

2 结 果

2.1miR-188-5p在宫颈癌组织中表达情况 宫颈癌组织中miR-188-5p的表达水平(0.34±0.03)低于癌旁组织(1.02±0.10，P<0.05)。

2.2过表达miR-188-5p对HeLa细胞增殖、凋亡的影响 miR-188-5p过表达可降低细胞存活率及CyclinD1、Bcl-2蛋白表达量，而促进细胞凋亡率及P21、Bax蛋白表达，而细胞克隆形成数减少(P<0.05)，见图1、表1。

A：过表达miR-188-5p对HeLa细胞克隆形成数的影响；B：过表达miR-188-5p对HeLa细胞凋亡的影响；C：过表达miR-188-5p对HeLa细胞增殖、凋亡蛋白表达的影响

2.3过表达miR-188-5p对HeLa细胞迁移、侵袭的影响 miR-188-5p过表达可促使迁移及侵袭细胞数减少，并可抑制MMP-2表达而促进E-cadherin表达(P<0.05)，见表1、图2。

A：过表达miR-188-5p对HeLa细胞迁移、侵袭能力的影响(结晶紫染色，×200)；B：过表达miR-188-5p对HeLa细胞迁移、侵袭蛋白表达的影响

2.4miR-188-5p靶向、调控Nek6 Nek6的3′UTR含有miR-188-5p的互补序列，见图3。miR-188-5p和WT-Nek6共转染组细胞荧光素酶活性低于miR-NC和WT-Nek6共转染组(P<0.05)，见表2。miR-188-5p可负向调控Nek6的表达(P<0.05)，见图4。与miR-NC组比较(0.95±0.10)，miR-188-5p组Nek6蛋白水平明显降低(0.34±0.03，P<0.05)；与anti-miR-NC组比较(0.97±0.10)，anti-miR-188-5p组Nek6蛋白水平升高(1.46±0.15，P<0.05)。

图3 Nek6的3′UTR含有miR-188-5p的互补序列

表2 双荧光素酶报告实验

1～4:miR-NC组，miR-188-5p组，anti-miR-NC组，anti-miR-188-5p组图4 miR-188-5p调控Nek6的表达

2.5抑制Nek6对HeLa细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭的影响 抑制Nek6表达可降低细胞存活率及CyclinD1、Bcl-2、MMP-2表达量，而促进细胞凋亡及P21、Bax、E-cadherin蛋白表达，克隆形成细胞数、迁移及侵袭细胞数减少(P<0.05)，见图5、表3。

A：抑制Nek6对HeLa细胞凋亡的影响；B：抑制Nek6对HeLa细胞迁移、侵袭的影响(结晶紫染色，×200)；C：抑制Nek6对HeLa细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭的影响

2.6过表达Nek6能逆转miR-188-5p对HeLa细胞增殖、凋亡的作用 miR-188-5p+pcDNA3.1-Nek6组HeLa细胞存活率、克隆细胞形成数高于miR-188-5p+pcDNA3.1组(P<0.05)，CyclinD1和Bcl-2蛋白水平高于miR-188-5p+pcDNA3.1组(P<0.05)，凋亡率、P21和Bax蛋白水平低于miR-188-5p+pcDNA3.1组(P<0.05)，见图6、图7、表4、图8。

图6 过表达Nek6能逆转miR-188-5p对HeLa细胞克隆形成的影响

图7 过表达Nek6能逆转miR-188-5p对HeLa细胞凋亡的影响

1～4：miR-NC组、miR-188-5p组、miR-188-5p+pcDNA3.1组、miR-188-5p+pcDNA3.1-Nek6组，图9同图8 Western印迹检测相关蛋白表达

2.7过表达Nek6能逆转miR-188-5p对HeLa细胞迁移、侵袭的作用 与miR-188-5p+pcDNA3.1组比较，miR-188-5p+pcDNA3.1-Nek6组HeLa细胞Nek6、MMP-2蛋白水平明显升高(P<0.05)，E-cadherin蛋白、miR-188-5p水平明显降低(P<0.05)，迁移与侵袭细胞数明显增多，差异有统计学意义(P<0.05)，见图9、表5、图10。

图9 过表达Nek6能逆转miR-188-5p对HeLa细胞迁移、侵袭能力的影响(结晶紫染色，×200)

图10 过表达Nek6能逆转miR-188-5p对HeLa细胞迁移、侵袭蛋白表达的影响

3 讨 论

胃癌、肝癌miR-188-5p表达下调有助于肿瘤细胞增殖转移〔8～10〕。miR-188-5p在乳腺癌细胞中呈低表达，并可通过靶向Rap2c的表达而促进乳腺癌细胞凋亡及抑制细胞增殖〔11〕。但miR-188-5p在宫颈癌中的表达状态尚未可知。本研究结果提示miR-188-5p可能通过抑制宫颈癌细胞增殖从而参与宫颈癌的发生过程。CyclinD1可正向调控细胞周期，促进细胞增殖，P21的作用与之相反〔12〕。本研究提示miR-188-5p可抑制宫颈癌细胞增殖。Bcl-2可发挥抗凋亡作用，Bax可发挥促凋亡作用〔13〕。本研究结果提示miR-188-5p可诱导宫颈癌细胞凋亡。E-cadherin上调可阻碍EMT进程，抑制肿瘤迁移及侵袭；MMP-2可降解细胞外基质并诱导肿瘤侵袭转移〔14〕。本研究结果提示miR-188-5p过表达可抑制宫颈癌细胞迁移及侵袭。

Nek6在结直肠腺癌、卵巢癌等肿瘤中的表达水平升高，并可发挥促癌基因作用〔15～17〕。本研究证实miR-188-5p可靶向结合Nek6，抑制Nek6的表达可抑制宫颈癌细胞增殖、迁移及侵袭，诱导细胞凋亡，Nek6过表达能逆转miR-188-5p过表达对宫颈癌细胞生物学行为的调控作用。

综上，miR-188-5p通过靶向负调控Nek6来诱导宫颈癌细胞凋亡，抑制其增殖、迁移及侵袭，为揭示miR-188-5p在宫颈癌的抑癌功能及作用机制提供新方向，为阐明宫颈癌的发病机制提供理论基础，可为宫颈癌的治疗提供新的潜在靶点。