异补骨脂素通过LncRNA THOR/miR-153-5p影响喉癌细胞Tu686增殖、迁移和侵袭的机制

徐茂林 陈晓华

(淄博市第一医院 1耳鼻咽喉科，山东 淄博 255200；2口腔科)

喉癌是耳鼻咽喉科最常见的恶性肿瘤，在头颈部原发恶性肿瘤中排名第二〔1，2〕。喉癌以男性患者居多，而女性则相对少见〔3〕。大多数喉癌由鳞状细胞发展而来，因此被称为鳞状细胞癌〔1〕。现阶段，虽然医学科学技术的进步已经改善了喉癌的治疗，包括手术、化疗、放疗、靶向药物等，但并不能提高喉癌患者的整体生存率〔4，5〕。提高喉癌的早期诊断率，早期预测复发及给予有效的干预措施是提高喉癌疗效的关键〔6，7〕。异补骨脂素是一种呋喃香豆素类化合物，是中药补骨脂最重要的活性成分之一〔8〕。研究发现，异补骨脂素对肝癌细胞HepG2的增殖具有明显抑制作用〔9〕，并通过抑制细胞自噬抑制人宫颈癌的恶性行为〔10〕。然而异补骨脂素对喉癌细胞生物学行为的影响尚未可知。长链非编码RNA(LncRNA)和微小RNA(miRNA)已被报道是参与喉癌进展的关键调控因子，如LncRNA INK4位点反义非编码RNA(ANRIL)通过调控miR-181a/锌指神经转录因子(Snai)2轴促进喉部鳞癌的增殖、克隆、侵袭和迁移〔11〕，LncRNA小核仁RNA宿主基因(SNHG)3通过调节miR-384/WEE1轴调控喉癌的增殖和迁移〔12〕。资料显示，LncRNA睾丸相关的高保守的致癌长链非编码RNA(THOR)在人的鼻咽癌组织和细胞中升高，LncRNA THOR的敲除抑制小鼠鼻咽癌异种移植肿瘤的生长〔13〕。miR-153-5p与肿瘤的发生发展密切相关，环状RNA(Circ RNA)Pan3基因第2～5外显子(PAN3)通过miR-153-5p/miR-183-5p-X连锁凋亡抑制蛋白(XIAP)轴介导急性髓系白血病耐药〔14〕，LncRNA CDKN2BAS可预测肝癌患者的不良预后，并通过miR-153-5p/ARHGAP18信号轴促进肝癌转移〔15〕。但LncRNA THOR与miR-153-5p在喉癌中的生物学功能仍不清楚。既往研究表明，雷公藤内酯酮通过阻断LncRNA THOR-胰岛素样生长因子2 mRNA结合蛋白(IGF2BP)1信号传导在体内和体外抑制鼻咽癌细胞的生长〔13〕，异补骨脂素对喉癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响是否与调控LncRNA THOR/miR-153-5p表达有关，值得探索。因此，本研究考察异补骨脂素对喉癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响，并对异补骨脂素是否通过LncRNA THOR/miR-153-5p影响喉癌细胞Tu686增殖、迁移和侵袭进行探讨，旨在阐明其潜在的分子机制。

1 材料与方法

1.1主要试剂 喉癌Tu686细胞购自美国典型培养物保藏中心(ATCC)，异补骨脂素(含量为99.5%)购自中国食品药品检定研究院，RPMI1640培养基购自美国Gibco公司，细胞核相关抗原(Ki-67)、增殖细胞核抗原(PCNA)、基质金属蛋白酶(MMP)-2、MMP-9、β肌动蛋白(β-actin)抗体购自美国Cellular Signaling Technology公司，辣根过氧化物酶标记二抗购自博士德生物公司，聚偏二氟乙烯(PVDF)膜购自美国Millipore公司，实时荧光定量PCR(qPCR)相关检测试剂盒购自日本TaKaRa公司，Trizol试剂、Lipofectamine 2000购自美国Invitrogen公司，si-LncRNA THOR、miR-153-5p、pcDNA-LncRNA THOR、anti-miR-153-5p及各自阴性对照、荧光素酶报告载体购自上海吉玛生物有限公司。

1.2细胞培养与处理 Tu686细胞中加入RPMI1640培养基，其中包含10%胎牛血清、1%青-链霉素，于37℃、5% CO2、饱和湿润的培养箱中生长。收集对数生长期的细胞，加入10、30、90 μg/ml〔8〕浓度的异补骨脂素，分别作为异补骨脂素低、中、高浓度组，将正常培养的Tu686细胞设为空白组，处理48 h后用于各项指标的检测。

1.3噻唑蓝(MTT)检测细胞增殖 Tu686细胞以1×104个/ml的密度接种于96孔板，培养24 h，弃去原有培养基，分别加入10、30、90 μg/ml浓度的异补骨脂素溶液，空白组不含异补骨脂素溶液，继续培养48 h，加入20 μl 0.5%的MTT溶液，培养4 h，加入150 μl的二甲基亚砜，振荡培养10 min，酶标仪测定Tu686细胞吸光度(OD)值，计算细胞增殖率，细胞增殖率(%)=实验组OD值/对照组OD值×100%。

1.4Transwell检测细胞迁移、侵袭 Tu686细胞迁移能力检测：Tu686细胞使用无血清RPMI1640培养基调整2×104个/ml的密度，在Transwell上室加入100 μl细胞悬液，下室加入500 μl含血清的RPMI1640培养基，孵育24 h，无菌棉签擦去多余细胞，4%甲醛固定，0.1%结晶紫染色，记录细胞迁移数。Tu686细胞侵袭能力检测：将基质胶与无血清RPMI1640培养基按1:5的比例稀释，吸取50 μl于上室，静置3～4 h。其余操作同Tu686细胞迁移能力检测。

1.5Western印迹检测Ki-67、PCNA、MMP-2、MMP-9蛋白表达 收集Tu686细胞，加入RIPA裂解液冰上提取细胞的蛋白。30 μg蛋白样品加入10%的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)进行电泳，转PVDF膜，经5%脱脂奶粉封闭1 h，加入Ki-67、PCNA、MMP-2、MMP-9(1∶1 000稀释)抗体4℃孵育过夜，使用TBST溶液洗PVDF膜10 min，洗涤3次，化学发光液显影，Image J软件分析蛋白灰度值。β-actin作为内参蛋白，计算Ki-67、PCNA、MMP-2、MMP-9蛋白表达。

1.6qPCR检测LncRNA THOR和miR-153-5p表达 使用TRIzol试剂提取Tu686细胞总RNA，按照逆转录试剂盒说明书进行cDNA的合成。以cDNA为模板，进行qPCR。LncRNA THOR正向引物序列为5′-CAAGGTGCTTCTCTCTGGATTT-3′，反向引物序列为5′-GCCAAAGTCATTTGTTGGGTAT-3′。miR-153-5p正向引物序列为5′-GGTGGCCAGTGTCATTTTTGT-3′，反向引物序列为5′-TTGTGACTATGCAACTGGGCT-3′。内参U6正向引物序列为5′-CTCGCTTCGGCAGCACATATACT-3′，反向引物序列为5′-ACGCTTCACGAATTTGCGTGTC-3′。根据Ct值，以2-ΔΔCt法计算LncRNA THOR和miR-153-5p表达。

1.7双荧光素酶报告实验 通过DINAN工具预测到LncRNA THOR与miR-153-5p的3′非编码区(3′UTR)具有靶向结合序列。分别构建包含miR-153-5p结合位点的野生型LncRNA THOR(WT-THOR)和突变型LncRNA THOR(MUT-THOR)的荧光素酶报告质粒，利用Lipofectamine 2000试剂，将WT-THOR、MUT-THOR分别与miR-con、miR-153-5p共转染，48 h后检测双荧光素酶活性。

1.8细胞转染 将5×105个/ml的Tu686细胞接种于6孔板，观察到细胞生长至70%融合时，严格依照Lipofectamine 2000试剂说明书的指示，将si-LncRNA THOR、miR-153-5p、pcDNA-LncRNA THOR、anti-miR-153-5p及各自阴性对照转染入细胞。其中，转染pcDNA-LncRNA THOR、anti-miR-153-5p的Tu686细胞使用90 μg/ml异补骨脂素处理，48 h后参照1.3～1.6中的方法检测细胞各项指标。

1.9统计学分析 采用SPSS22.0软件进行t检验、单因素方差分析、SNK-q检验。

2 结 果

2.1异补骨脂素对喉癌细胞增殖和增殖相关蛋白表达的影响 与空白组比较，异补骨脂素低、中、高浓度组明显减少Tu686细胞中Ki-67、PCNA蛋白表达量、细胞增殖率，并呈浓度依赖性(P<0.05)。见表1、图1。

1～4：空白组，异补骨脂素低浓度组，异补骨脂素中浓度组，异补骨脂素高浓度组；图2同图1 Western印迹检测喉癌细胞增殖相关蛋白的表达

2.2异补骨脂素对喉癌细胞迁移、侵袭和转移相关蛋白表达的影响 与空白组比较，异补骨脂素低、中、高浓度组显著减少Tu686细胞的MMP-2、MMP-9蛋白表达量、细胞迁移数和细胞侵袭数，且呈浓度依赖性(P<0.05)。见表1、图2。

图2 Western印迹检测喉癌细胞转移相关蛋白的表达

2.3异补骨脂素对喉癌细胞LncRNA THOR和miR-153-5p表达的影响 与空白组比较，异补骨脂素低、中、高浓度组明显减少Tu686细胞内LncRNA THOR表达量，而显著增加miR-153-5p表达量，均呈浓度依赖性(P<0.05)。见表2。

表2 不同浓度的异补骨脂素对喉癌细胞LncRNA THOR和miR-153-5p表达的影响

2.4LncRNA THOR靶向调控miR-153-5p DINAN工具预测出LncRNA THOR与miR-153-5p存在互补配对的碱基序列(图3)。与miR-con组比较，miR-153-5p明显降低WT-THOR荧光素酶相对活性(P<0.05)，对MUT-THOR荧光素酶相对活性无显著影响(表3)。与si-con组(0.97±0.05)比较，转染si-LncRNA THOR明显增加miR-153-5p表达量(5.17±0.64，P<0.05)；与pcDNA组(0.99±0.07)比较，转染pcDNA-LncRNA THOR显著减少miR-153-5p表达量(0.53±0.08，P<0.05)。

图3 LncRNA THOR与miR-153-5p存在靶向序列

表3 双荧光素酶报告实验

2.5沉默LncRNA THOR或过表达miR-153-5p抑制喉癌细胞增殖、迁移和侵袭 与si-con组比较，沉默LncRNA THOR明显减少Tu686细胞的LncRNA THOR表达量、Ki-67、PCNA、MMP-2、MMP-9蛋白表达量、细胞增殖率、细胞迁移数、细胞侵袭数，显著提高miR-153-5p表达量(P<0.05)。与miR-con组比较，过表达miR-153-5p明显降低Tu686细胞的LncRNA THOR表达量、Ki-67、PCNA、MMP-2、MMP-9蛋白水平、细胞增殖率、细胞迁移数、细胞侵袭数，显著增加miR-153-5p表达量(P<0.05)。见图4、表4。

1～4：si-con组、si-LncRNA THOR组、miR-con组、miR-153-5p组图4 Western印迹检测喉癌细胞增殖和转移相关蛋白表达的表达

2.6过表达LncRNA THOR或干扰miR-153-5p部分逆转异补骨脂素对喉癌细胞的抑制作用 与异补骨脂素+pcDNA组比较，过表达LncRNA THOR明显增加异补骨脂素处理的Tu686细胞中LncRNA THOR表达量、Ki-67、PCNA、MMP-2、MMP-9蛋白表达量、细胞增殖率、细胞迁移数、细胞侵袭数，显著减少miR-153-5p表达量(P<0.05)。与异补骨脂素+anti-miR-con组比较，干扰miR-153-5p明显减少异补骨脂素处理后Tu686细胞的LncRNA THOR表达量，显著增加miR-153-5p表达量、Ki-67、PCNA、MMP-2、MMP-9蛋白表达量、细胞增殖率、细胞迁移数、细胞侵袭数(P<0.05)。见表5、图5。

3 讨 论

本研究发现，不同浓度的异补骨脂素对喉癌细胞增殖、迁移和侵袭具有明显的抑制作用，显示出治疗喉癌的潜力。喉癌敏感生物标志物的有效筛选和应用是喉癌诊断和治疗的关键。本研究还发现，LncRNA THOR和miR-153-5p与喉癌的发生和转移联系紧密，沉默LncRNA THOR或过表达miR-153-5p能够抑制喉癌细胞增殖、迁移和侵袭，而调控LncRNA THOR/miR-153-5p表达可能解释了异补骨脂素对喉癌的细胞毒性作用，为喉癌诊治提供了有价值的生物标志物。

补骨脂始载于《开宝本草》〔8〕，来源于豆科植物补骨脂Psoralea corylifolia L.的干燥成熟果实，具有温肾助阳，纳气平喘，温脾止泻的功效，外用能够消风祛斑，临床用于肾阳不足，阳痿遗精，遗尿尿频，腰膝冷痛，肾虚作喘，五更泄泻，外用治白癜风，斑秃〔16〕。异补骨脂素是补骨脂的质控指标之一，现代药理研究显示，异补骨脂素具有抗肿瘤〔17〕、抗炎〔18〕、雌激素样〔19〕、抗骨质疏松〔20〕、抗氧化〔21〕等作用。根据报道，异补骨脂素可明显诱导人肺癌细胞凋亡并抑制细胞周期，以剂量依赖的方式抑制了非小细胞肺癌A549细胞的迁移，另外，A549细胞经异补骨脂素处理后，MMP-2和MMP-9表达显著降低，异补骨脂素通过诱导细胞凋亡，阻滞细胞周期并抑制人肺癌A549细胞的迁移而发挥抗肿瘤和抗转移活性〔22〕。异补骨脂素和补骨脂素对骨肉瘤裸鼠移植瘤具有生长抑制作用，可诱导肿瘤细胞凋亡或坏死，对骨髓没有明显的毒性副作用〔23〕。本实验结果与前人研究〔22〕一致，提示异补骨脂素可以抑制喉癌细胞的增殖和转移，具有抑癌的作用。

有证据支持LncRNA和miRNA在人类生理和病理过程，包括喉癌〔24〕。LncRNA是一类内源RNA分子，长度超过200个核苷酸。miRNA是一类长度约为22个核苷酸的短链非编码RNA。LncRNA THOR是LncRNA家族的成员，可以调节细胞的生长，在肿瘤进展中起重要作用。LncRNA THOR在人胶质瘤组织和细胞中高表达，敲除LncRNA THOR可有效抑制细胞存活和增殖，同时诱导胶质瘤细胞凋亡，其过表达则促进了胶质瘤细胞的生长和迁移〔25〕。在人类骨肉瘤组织中也检测到LncRNA THOR的表达，但在周围正常骨组织中没有，敲除LncRNA THOR可显著抑制人骨肉瘤细胞的存活和增殖，LncRNA THOR的过表达具有相反的作用〔26〕，表明LncRNA THOR在癌症中可能充当致癌基因，促进癌症的发生发展。miR-153-5p被报道在癌症转移、复发和进展中发挥重要作用〔14〕。本研究结果说明，沉默LncRNA THOR或过表达miR-153-5p可以抑制喉癌Tu686细胞增殖、迁移和侵袭能力，而调控LncRNA THOR/miR-153-5p的表达可能是异补骨脂素发挥抗喉癌活性的重要途径之一。

综上，异补骨脂素通过抑制喉癌Tu686细胞的增殖、迁移和侵袭，显示出一定的抗增殖和抗转移活性。这些作用的分子机制与调控LncRNA THOR和miR-153-5p表达有关。此外，沉默LncRNA THOR或过表达miR-153-5p对喉癌Tu686细胞的增殖、迁移和侵袭具有抑制作用。因此，异补骨脂素可能是用于治疗喉癌的潜在治疗剂，LncRNA THOR/miR-153-5p可能成为人类喉癌新的治疗靶点和(或)诊断标记。