miR-18a-5p调控PSORS1C1对类风湿关节炎成纤维细胞样滑膜细胞迁移、侵袭及炎症反应的影响

蒋磊 陈汉玉 彭旭玲 胡周静 罗茜 张永红 兰培敏

(十堰市太和医院慢性病1病区，湖北 十堰 442099)

类风湿关节炎是一种慢性自身免疫性疾病，患者具有极高致残率且严重降低生存质量，研究表明类风湿关节炎与细胞内因子及蛋白表达异常有关〔1,2〕。类风湿关节炎患者滑膜成纤维细胞(SFs)可为关节腔及其周围组织提供营养，但SFs异常活化可促进白细胞介素(IL)-1等炎症因子释放进而破坏关节组织〔3〕。因而寻找SFs活化相关基因并探究其可能作用机制对治疗类风湿关节炎具有重要意义。研究表明微小RNA(miRNA)可调节细胞生长及发育等过程，miRNA表达异常与类风湿关节炎发生及发展密切相关，但仍有部分miRNA在类风湿关节炎发生过程中的分子机制尚未完全阐明〔4〕。研究发现miR-18a在类风湿关节炎关节成纤维样滑膜细胞中表达降低，其可能通过调控炎性细胞因子分泌而参与类风湿关节炎的发病机制〔5〕。但miR-18a-5p对类风湿关节炎成纤维细胞样滑膜细胞迁移、侵袭及炎症反应的影响及其机制尚未可知。靶基因预测显示银屑病易感基因 1 候选基因(PSORS1C)1可能为miR-18a-5p的靶基因，研究发现PSORS1C1在类风湿关节炎患者滑膜组织中上调表达，PSORS1C1可能参与滑膜组织的病变，但关于其是否通过其他途径影响类风湿关节炎发生或发展尚未阐明〔6,7〕。因此，本研究分析miR-18a-5p对类风湿关节炎关节成纤维样滑膜细胞迁移、侵袭及炎症反应的影响，探究其是否可调控PSORS1C1表达及其可能作用机制。

1 材料与方法

1.1材料与试剂 MH7A购自广州吉妮欧生物科技有限公司；正常人关节成纤维样滑膜细胞HFLS购自江苏无锡菩禾生物技术有限公司；10%胎牛血清DMEM培养基均购自美国Gibco公司；RNA提取试剂盒购自北京百泰克生物技术有限公司；miR-18a-5p mimics及阴性对照均购自北京英格恩生物科技有限公司；miR-18a-5p抑制物(anti-miR-18a-5p)及其阴性对照(anti-miR-NC)、siRNA PSORS1C1(si-PSORS1C1)及其阴性对照(si-NC)均购自广州锐博生物科技有限公司；兔抗人基质金属蛋白酶(MMP)-2、钙黏附蛋白-E(E-cadherin)、PSORS1C1抗体与辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗兔二抗均购自美国CST公司；Transwell小室购自北京萌壮科技有限公司；基质胶购自美国BD公司；蛋白提取试剂盒购自江苏凯基生物技术股份有限公司；IL-1、IL-2检测试剂盒均购自南京建成生物工程研究所；Lipofectamine2000购自美国Invitrogen公司；反转录试剂盒及qRT-聚合酶链反应(PCR)试剂盒均购自大连宝生物工程有限公司。

1.2方法

1.2.1细胞转染及实验分组 收集对数生长期MH7A细胞，待细胞生长融合至50%时进行转染，细胞随机分为miR-18a-5p组(转染miR-18a-5p mimics)、miR-NC组(转染阴性对照)、si-PSORS1C1组(转染siRNA PSORS1C1)、si-NC组(转染阴性对照si-NC)、miR-18a-5p+pcDNA3.1-PSORS1C1组(转染miR-18a-5p mimics后再转染PSORS1C1过表达质粒)、miR-18a-5p+pcDNA3.1组(转染miR-18a-5p mimics后再转染空质粒)，转染后6 h更换DMEM完全培养基，继续培养48 h，将转染成功的细胞用于实验。

1.2.2qRT-PCR检测细胞中miR-18a-5p表达水平 按照RNA提取试剂盒提取细胞总RNA，反转录合成第1链cDNA，qRT-PCR体系：染科法实时荧光定量试剂盒10 μl，cDNA 2 μl，上下游引物各0.8 μl，荧光定量PCR多比染料0.4 μl，ddH2O 补足体系至20 μl。qRT-PCR条件：95℃预变性3 min循环1次，95℃变性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s(共循环40次)。采用2-ΔΔCt法计算miR-18a-5p的相对表达量。

1.2.3Transwell实验检测细胞迁移及侵袭 细胞侵袭实验：取对数生长期各组MH7A细胞，加入无血清DMEM培养基重悬细胞，调整细胞浓度为1×108个/L，用孔径8 μm的聚碳酸酯微膜孔将其分隔为上室与下室，小室的上室平铺稀释基质胶，取500 μl含有10%胎牛血清的DMEM培养基加入洗扫灰的下室，取300 μl细胞悬液加入小室的上室，放入37℃、体积分数5%CO2培养箱继续培养24 h，取出聚碳酸酯微膜，使用棉签擦去内层细胞，PBS洗涤，多聚甲醛固定20 min，结晶紫溶液染色20 min，显微镜下随机选取10个视野观察计数。细胞迁移实验：小室的上室不用平铺稀释基质胶，其余步骤同细胞侵袭实验。

1.2.4荧光素酶报告基因检测 构建含有miR-18a-5p与PSORS1C1结合位点及其突变位点的荧光素酶报告基因载体，分别为野生型WT-PSORS1C1、突变型MUT-PSORS1C1，将WT-PSORS1C1、MUT-PSORS1C1分别与miR-18a-5p mimics、miR-NC共转染MH7A细胞，继续培养24 h，参照荧光素酶活性检测试剂盒说明书检测MH7A细胞荧光素酶活性。

1.2.5Western印迹检测PSORS1C1、MMP-2、E-cadherin蛋白表达 收集各组MH7A细胞，加入蛋白裂解液，离心后提取细胞总蛋白，邻苯三酚红钼法测定蛋白浓度，高温煮沸，蛋白变性，取30 μg蛋白上样，进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离蛋白，反应结束后将其转移硝酸纤维素膜，室温条件下用5%脱脂奶粉封闭1 h，加一抗，4℃孵育24 h，TBST清洗，加入二抗，室温孵育2 h，TBST洗膜，滴加电化学(ECL)显影，置于凝胶呈现系统扫描，Quantityone软件检测条带灰度值。

1.2.6检测细胞上清液中IL-1、IL-2水平 收集各组细胞上清液，按照IL-1、IL-2检测试剂盒说明书检测细胞上清液中IL-1、IL-2水平，严格按照试剂盒说明书进行操作。

1.3统计学处理 采用SPSS21.0软件进行t检验、单因素方差分析。

2 结 果

2.1miR-18a-5p在细胞HFLS和MH7A中的表达 与HFLS细胞中miR-18a-5p表达水平(0.92±0.09)相比，MH7A细胞显著降低(0.23±0.02，P<0.05)。

2.2过表达miR-18a-5p对细胞MH7A迁移、侵袭及炎症因子的影响 与miR-NC组相比，miR-18a-5p组迁移及侵袭细胞数均显著减少，IL-1水平与MMP-2蛋白表达均显著降低(P<0.05)，而IL-2水平与E-cadherin蛋白表达均显著升高(P<0.05)，见图1、表1、图2。表明miR-18a-5p过表达可显著抑制MH7A细胞迁移及侵袭，并可有效减缓炎症反应。

图1 过表达miR-18a-5p对细胞MH7A迁移、侵袭的影响(结晶紫，×200)

图2 过表达miR-18a-5p对细胞MH7A迁移、侵袭蛋白表达的影响

2.3miR-18a-5p靶向、调控PSORS1C1的表达 Targetscan靶基因预测网站显示PSORS1C1的3′UTR区存在miR-18a-5p结合位点，见图3。双荧光素酶报告基因实验显示，相比共转染miR-NC、WT-PSORS1C1的MH7A细胞，共转染miR-18a-5p mimics、WT-PSORS1C1的MH7A细胞荧光素酶活性显著降低(P<0.05)；而与共转染miR-NC、MUT-PSORS1C1的MH7A细胞相比，共转染miR-18a-5p mimics、MUT-PSORS1C1的MH7A细胞荧光素酶活性无显著性变化(P>0.05)，见表2。表明miR-18a-5p可靶向结合PSORS1C1。Western印迹检测结果显示，与miR-NC组PSORS1C1蛋白表达水平(0.73±0.07)相比，miR-18a-5p组(0.14±0.01)显著降低(P<0.05)；与anti-miR-NC组RSORS1C1蛋白表达水平(0.74±0.07)相比，anti-miR-18a-5p组(1.15±0.11)显著升高(P<0.05)，见图4。

1～4:miR-NC组，miR-18a-5p组，anti-miR-NC组，anti-miR-18a-5p组图3 miR-18a-5p靶向PSORS1C1

表2 双荧光素酶报告实验

图4 miR-18a-5p调控PSORS1C1的表达

2.4抑制PSORS1C1对细胞MH7A迁移、侵袭及炎症因子的影响 与si-NC组相比，si-PSORS1C1组迁移及侵袭细胞数均显著减少(P<0.05)，IL-1水平与MMP-2蛋白表达水平均显著降低(P<0.05)，而IL-2水平与E-cadherin蛋白表达水平均显著升高(P<0.05)，见图5、表3。

图5 抑制PSORS1C1对细胞MH7A迁移、侵袭蛋白表达的影响

2.5过表达PSORS1C1能逆转miR-18a-5p对细胞MH7A迁移、侵袭及炎症因子的影响 与miR-18a-5p+pcDNA3.1组相比，miR-18a-5p+pcDNA3.1-PSORS1C1组迁移及侵袭细胞数均显著增加(P<0.05)，IL-1水平与MMP-2蛋白表达水平均显著升高(P<0.05)，而IL-2水平与E-cadherin蛋白表达水平均显著降低(P<0.05)，见表4、图6。

1～2：miR-18a-5p+pcDNA3.1组;miR-18a-5p+pcDNA3.1-PSORS1C1组图6 过表达PSORS1C1能逆转miR-18a-5p对细胞MH7A迁移、侵袭蛋白表达的影响

3 讨 论

类风湿关节炎主要以手、足小关节的炎症反应为主要病理特征，常伴有关节外器官受累、免疫功能指标异常等导致患者关节畸形甚至诱发功能障碍〔8〕。Toll样受体可通过促进炎症因子的释放而促进类风湿关节炎发生及发展〔9〕。研究表明部分miRNA可通过抑制SFs增殖及侵袭能力进而抑制类风湿关节炎的发生〔10〕。

miR-18a-5p在动脉粥样硬化疾病等其他心血管疾病中的表达水平降低，并可能作为临床诊断心血管疾病发生的有效指标〔11〕。沉默LncRNA H19可通过上调miR-18a-5p表达而抑制胎儿生长受限中绒毛外滋养层细胞增殖及侵袭〔12〕。LncRNA GAS5通过负调节miR-18a-5p而调控胶质瘤细胞增殖、迁移及侵袭〔13〕。miR-18a-5p通过调控Notch2途径而抑制内皮-间质转化及心脏纤维化〔14〕。研究表明MMP-2、E-cadherin表达异常与细胞迁移及侵袭能力有关，MMP-2与细胞迁移及侵袭能力呈正相关，而E-cadherin与细胞迁移及侵袭能力呈负相关〔15,16〕。提示miR-18a-5p过表达可能通过抑制MMP-2表达及上调E-cadherin表达进而抑制MH7A细胞迁移及侵袭。已有报道指出IL-1可诱导类风湿关节炎关节滑膜细胞增殖并增强IL-6等炎性因子的作用，IL-2属于免疫调节因子并可抑制促炎性细胞因子及趋化因子的释放，同时还可抑制MMPs表达进而保护软骨细胞〔17〕。提示miR-18a-5p过表达可通过调节细胞免疫功能进而抑制类风湿关节炎关节滑膜细胞迁移及侵袭。

PSORS1C1基因多态性与类风湿关节炎密切相关，还可能与强直性脊柱炎发生及发展有关〔18～20〕。本研究结果提示miR-18a-5p 过表达可通过下调PSORS1C1表达而降低MH7A细胞迁移、侵袭能力，并减轻机体炎症反应程度。

综上，miR-18a-5p 可有效抑制SFs迁移及侵袭能力，减轻炎症反应，在类风湿关节炎发生过程中发挥重要调控作用，其作用机制与下调PSORS1C1的表达有关。