INPP4B调控Akt信号通路抑制胃癌HGC-27细胞增殖并诱导细胞凋亡

商倩 陈鑫 王邦茂 杨波 朱兰平

(1天津医科大学总医院消化内科，天津 300041；2保定市第一医院消化内科)

恶性肿瘤已经成为目前威胁人类生命健康的常见疾病之一，其具有恶性程度高、致死率高、病程快等特点，研究恶性肿瘤分子发生机制，寻找有效的靶基因抑制恶性肿瘤进程是目前研究的热点〔1〕。脂酰肌醇4-磷酸酶Ⅱ型(INPP4B)作为一种脂质磷酸酶，其对细胞内磷酸激酶稳态的维持具有关键作用〔2〕。INPP4B参与细胞增殖和凋亡调控过程，其是目前研究发现的与肿瘤有关的调节基因〔3〕。研究显示，INPP4B在卵巢癌中表达下调，上调其表达可以诱导卵巢癌细胞凋亡〔4〕。后续的实验研究证实，INPP4B在乳腺癌、前列腺癌等多种肿瘤中均扮演抑制作用，INPP4B可以通过调控蛋白激酶B(Akt)信号通路的激活水平发挥生物学作用〔5,6〕。目前已知INPP4B在胃癌组织中表达下调，并且其表达水平的高低与胃癌分化程度以及TNM分期相关，INPP4B可能是胃癌进展中的抑制因子〔7〕。现阶段对于INPP4B在胃癌细胞增殖、凋亡中的作用还不明确。本研究旨在探讨INPP4B在胃癌细胞和正常胃黏膜细胞中的表达差异，通过慢病毒感染的方式上调胃癌细胞中INPP4B的表达水平，明确INPP4B对胃癌细胞增殖和凋亡的影响和机制。

1 材料与方法

1.1材料 胃癌细胞AGS、HGC-27、NCI-N87购自上海慧颖生物科技有限公司；正常胃黏膜细胞GES-1购自上海艾研生物科技有限公司；B细胞淋巴瘤(Bcl)-2相关X蛋白(Bax)抗体购自武汉艾美捷科技有限公司；INPP4B过表达慢病毒和对照慢病毒由上海吉凯基因化学技术有限公司合成；Bcl-2抗体购自青岛捷世康生物科技有限公司；p-Akt抗体购自厦门研科生物技术有限公司。

1.2实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)方法测定INPP4B在胃癌细胞中的表达 收集胃癌细胞AGS、HGC-27、NCI-N87和正常胃黏膜细胞GES-1，提取细胞总RNA，合成cDNA。cDNA合成体系为：2 μl的随机引物、20 μl的2×TS反应混合物、2 μg总RNA、2 μl的去除DNA、2 μl的TransScript RT/RI Enzyme Mix，添加无RNA酶水至40 μl。cDNA合成条件为：25℃孵育10 min；42℃孵育30 min；85℃孵育5 min；4℃终止反应。收集cDNA，进行实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)检测，引物为：INPP4B正义链-5′-GGAAAGTGTGAGCGGAAAAG-3′，反义链-5′-CGA ATTCGCATCCACTTATTG-3′。β-actin正义链-5′-TA GTTGCGTTACACCCTTTCTTG-3′，反义链-5′-TGCTGTCACCTTCACCGTTC-3′。反应体系为：10 μl的2×TS Top Green qPCR SuperMix、0.3 μl的上下游引物、0.4 μl的Passive Reference Dye、0.5 μl的cDNA，添加ddH2O至10 μl。PCR条件设置为：95℃ 50 s，74℃ 5 s，60℃ 34 s。INPP4B mRNA定量方法为2-△△Ct法。

1.3Western印迹测定INPP4B在胃癌细胞中的表达 收集胃癌细胞AGS、HGC-27、NCI-N87和正常胃黏膜细胞GES-1，提取细胞总蛋白，二喹啉甲酸(BCA)方法检测蛋白浓度。使用5%的浓缩胶和8%的分离胶进行电泳，蛋白上样量为30 μg。提取的蛋白样品在添加至上样孔之前与结合缓冲液混合煮沸5 min。初始电压为60 V，观察预染Marker进入到分离胶时，把电压调整到90 V。取出凝胶，以半干法将蛋白转移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜(0.45 μm)上，转膜时电压调整为15 V，转膜时间设置为50 min。PVDF膜分别依次放在封闭液(5%牛血清白蛋白)、一抗(以1∶100稀释)、二抗(以1∶4 000稀释)反应液中充分结合。在PVDF膜上滴加ECL超敏发光工作液，以Bio-rad采集图像，根据灰度值分析蛋白表达量，内参为β-actin。

1.4慢病毒感染 HGC-27细胞接种到6孔板中，培养24 h以后，以MOI=30进行慢病毒感染，培养24 h以后换液，继续培养72 h以后，用嘌呤霉素筛选5 d后用于后续实验。将感染INPP4B过表达慢病毒和对照慢病毒的HGC-27细胞命名为INPP4B和NC组，把没有添加慢病毒液的HGC-27细胞命名为Control组。收集Control、NC、INPP4B组细胞，用实时荧光定量PCR和Western印迹测定细胞中INPP4B表达变化，步骤同1.2和1.3。

1.5四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法测定上调INPP4B对HGC-27细胞增殖影响 Control、NC、INPP4B组按照每孔4 000个细胞种植到96孔板，在细胞培养48 h以后取出细胞培养板，在每个孔内依次添加MTT工作液各20 μl，孵育4 h以后将上清弃掉。在每个孔中加入150 μl的DMSO溶液，孵育震荡10 min以后，在酶标仪上检测490 nm的A值。

1.6流式细胞术测定上调INPP4B对HGC-27细胞凋亡影响 收集Control、NC、INPP4B组细胞(每组106个细胞)，用PBS溶液洗涤3次以后，添加200 μl的结合缓冲液将细胞悬浮，再添加Annexin V-FITC和PI染色液各5 μl，置于避光条件下孵育结合15 min。用流式细胞仪检测凋亡变化。

1.7Western印迹测定上调INPP4B对HGC-27细胞Bax、Bcl-2、p-Akt蛋白表达影响 收集Control、NC、INPP4B组细胞，按照1.3中Western印迹测定细胞中Bax、Bcl-2、p-Akt蛋白表达，Bax、Bcl-2、p-Akt抗体稀释倍数分别为1∶600、1∶800、1∶400。

1.8Akt信号激活剂对上调INPP4B的HGC-27细胞增殖、凋亡影响 将感染INPP4B过表达慢病毒的HGC-27细胞用含50 ng/ml AKT信号通路激活剂IGF-1的细胞培养液培养，记为INPP4B+IGF-1组，以INPP4B组细胞作为参照，细胞培养48 h以后，按照1.5中MTT比色法测定细胞增殖，按照1.6中流式细胞术方法测定细胞凋亡，按照1.7中Western印迹测定Bax、Bcl-2、p-Akt蛋白表达。

1.9统计学分析 采用SPSS21.0软件进行t检验、单因素方差分析、SNK-q检验。

2 结 果

2.1INPP4B在胃癌细胞中表达下调 胃癌细胞AGS、HGC-27、NCI-N87中INPP4B蛋白和mRNA水平明显低于正常胃黏膜细胞GES-1(P<0.05)；胃癌细胞HGC-27中INPP4B蛋白和mRNA水平明显低于胃癌细胞AGS、NCI-N87(P<0.05)。见图1、表1。INPP4B在胃癌细胞中表达下调，选用表达水平最低的胃癌细胞HGC-27作为研究对象。

图1 Western印迹检测INPP4B在胃癌细胞中的表达变化

表1 正常胃黏膜细胞GES-1和胃癌细胞AGS、HGC-27、NCI-N87中INPP4B mRNA和蛋白水平

2.2INPP4B慢病毒感染上调HGC-27细胞中INPP4B表达水平 INPP4B慢病毒感染后的HGC-27细胞中INPP4B蛋白和mRNA水平均明显升高(P<0.05)。见图2、表2。

图2 Western印迹检测INPP4B慢病毒感染后HGC-27细胞中INPP4B蛋白表达

2.3上调INPP4B抑制HGC-27细胞增殖并诱导细胞凋亡 INPP4B慢病毒感染后的HGC-27细胞A值明显降低，细胞凋亡率明显升高，Bax蛋白表达水平明显升高，Bcl-2蛋白表达水平明显降低(P<0.05)。见表2、图3、图4。上调INPP4B抑制HGC-27细胞增殖并诱导细胞凋亡。

图3 流式细胞术检测上调INPP4B对HGC-27细胞凋亡影响

图4 Western印迹检测上调INPP4B对HGC-27细胞中Bax、Bcl-2蛋白表达影响

2.4上调INPP4B抑制HGC-27细胞中p-Akt蛋白表达 INPP4B慢病毒感染后的HGC-27细胞中p-Akt蛋白表达水平明显降低(P<0.05)。见表2、图5。

图5 Western印迹检测INPP4B慢病毒感染后HGC-27细胞中p-Akt蛋白水平

2.5Akt信号激活剂对上调INPP4B的HGC-27细胞中p-Akt蛋白表达影响 INPP4B+IGF-1组p-Akt蛋白(0.62±0.06)明显高于INPP4B组(0.34±0.06，P<0.05)。见图6。

图6 Western印迹检测Akt信号激活剂对INPP4B慢病毒感染后HGC-27细胞中p-Akt蛋白表达影响

2.6Akt信号激活剂对上调INPP4B的HGC-27细胞增殖和凋亡影响 Akt信号激活剂IGF-1处理INPP4B慢病毒感染后的HGC-27细胞，细胞A值明显升高，凋亡率明显降低，细胞中Bax蛋白表达明显减少，Bcl-2蛋白表达明显增加(P<0.05)。见图7、图8、表3。

图7 流式细胞术检测Akt信号激活剂对INPP4B慢病毒感染后HGC-27细胞凋亡影响

图8 Western印迹检测Akt信号激活剂对INPP4B慢病毒感染后HGC-27细胞中Bax、Bcl-2蛋白表达影响

表3 Akt信号激活剂处理INPP4B慢病毒感染后的HGC-27细胞A值、凋亡率和Bax、Bcl-2蛋白水平

3 讨 论

INPP4B基因定位在人4号染色体上，具有C2脂质结合域、磷酸酶结构域和内部神经质同源结构域2，其可以去磷酸化磷脂酰肌醇而维持细胞内磷脂酰肌醇的稳态〔8〕。INPP4B与肿瘤细胞的增殖和凋亡有关，其可以抑制恶性肿瘤的生长，INPP4B被认为是一种抑癌基因〔4〕。上调INPP4B后的宫颈癌、乳腺癌细胞增殖能力明显下降，细胞凋亡增多〔5,9〕。INPP4B在胃癌组织中表达下调，并且INPP4B表达变化与胃癌患者的TNM分期有关〔7〕。本研究结果表明INPP4B在胃癌细胞中表达下调，上调INPP4B可以抑制胃癌细胞的增殖并诱导胃癌细胞凋亡，说明INPP4B在胃癌中扮演抑制作用，这与上述研究结果相一致。细胞的凋亡是一个复杂过程，其受到细胞内多种信号和基因的表达调控作用〔10〕。与细胞凋亡有关的调控蛋白有多种，其中Bcl-2是最为重要的与凋亡有关的蛋白家族之一〔11〕。Bcl-2蛋白家族成员在细胞凋亡过程中扮演的角色不同，其蛋白成员可以分成促凋亡蛋白和抑凋亡蛋白〔12〕。Bax是Bcl-2蛋白家族中的促凋亡蛋白，在细胞凋亡发生时发挥诱导作用；Bcl-2在细胞凋亡发生时发挥抑制作用〔13～15〕。本研究结果说明上调INPP4B诱导胃癌细胞凋亡发生。

INPP4B作用机制与细胞内信号转导过程有关。INPP4B是位于Akt信号通路上的一种蛋白酶，其可以作用于磷脂酰肌醇的D4磷酸基团，降低Akt的活化水平，从而阻断Akt信号激活〔16，17〕。Akt是一个多功能信号通路，与细胞的生长、分化及胚胎发育等有关，参与心血管系统疾病、免疫疾病的发生〔18～20〕。Akt在肿瘤组织中过度激活，其活化水平的高低与Akt磷酸化水平有关，p-Akt蛋白水平越高，Akt信号通路激活水平也就越高〔21，22〕。在卵巢癌中证实，INPP4B可以通过下调Akt信号通路的激活水平诱导细胞凋亡发生〔4〕。本研究结果说明INPP4B抑制胃癌细胞增殖和诱导胃癌细胞凋亡与调控Akt信号通路有关。