miR-375调控PIAS1对急性胰腺炎腺泡细胞增殖、凋亡的影响

杜慧清 杜慧静 耿栋栋

(1新乡市中心医院急诊科，河南 新乡 453000；2新乡医学院第三附属医院急诊科)

急性胰腺炎(AP)是急诊科常见急腹症的主要类型，根据疾病严重程度分为轻度、中度及重度，而重度AP患者治疗后预后较差且具有较高的死亡率〔1〕。胰腺腺泡细胞凋亡与增殖比例失衡是导致AP发生及发展的重要原因之一〔2〕。因而如何抵抗胰腺腺泡细胞凋亡及促进细胞增殖对研制AP新型治疗药物有重要参考价值。研究表明在AP大鼠胰腺中信号转导和转录激活子1的活化抑制蛋白(PIAS1)的表达水平显著降低，其表达水平与AP病情严重度呈负相关，并可作为预测病情严重程度及预后的重要指标〔3〕。沉默PIAS1基因表达可增强雨蛙肽活化的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(caspase)-3凋亡途径而促使胰腺腺泡细胞凋亡进而促进炎症的发生〔4,5〕，结果表明PIAS1可参与AP发生及发展过程，但关于其具体作用机制尚未完全阐明。相关研究对胰腺炎组、正常组进行芯片分析发现在AP患者血清中微小RNA-375(miR-375)表达上调，进一步研究发现miR-375可通过靶向YAP1抑制胰腺细胞增殖〔6,7〕。但miR-375对AP腺泡细胞的影响及其机制研究尚未完全阐明。经靶基因预测软件分析发现PIAS1可能是miR-375的靶基因，由此猜测miR-375可能通过调控PIAS1表达进而参与AP发生及发展过程。因此，本研究用雨蛙素(CAE)处理胰腺腺泡细胞株 AR42J构建AP模型，观察miR-375、PIAS1表达，并分析下调miR-375表达后其对AR42J细胞增殖及凋亡的影响，初步探讨其是否通过调控PIAS1表达而发挥作用。

1 材料与方法

1.1材料与试剂 胰腺腺泡细胞株 AR42J购自美国ATCC细胞保藏中心。RPMI1640培养基购自美国Gibco公司；CAE购自上海博研生物工程研究中心；胰蛋白酶与胎牛血清均购自武汉碧云天生物有限公司；Trizol试剂与Lipofectamine2000转染试剂均购自美国Invitrogen公司；膜联蛋白V(Annexin V)-异硫氰酸荧光素(FITC)细胞凋亡试剂盒购自美国BD公司；反转录试剂盒购自上海生工生物工程股份有限公司；实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)试剂盒购自北京天根生化科技有限公司；RIPA细胞裂解液购自上海博彩生物科技有限公司；兔抗鼠B细胞淋巴瘤(Bcl)-2、Bcl-2相关X蛋白(Bax)多克隆抗体与辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗兔IgG二抗均购自美国Santa Cruz公司；兔抗鼠CyclinD1、P21一抗购自武汉博士德生物技术公司；GAPDH一抗购自美国Abcam公司；噻唑蓝(MTT)检测试剂盒购自上海士锋生物科技有限公司；miR-375模拟物(miR-375 mimics)、miR-375抑制剂(anti-miR-375)及其相应阴性对照均购自西安沃尔森生物技术有限公司；si-PIAS1、si-NC均购自广州锐博生物科技有限公司；Gene TailorTMSite-Directed Mutagenesis System试剂盒购自美国Invitrogen公司；双荧光素酶报告基因检测系统购自美国Biovision公司。

1.2方法

1.2.1细胞培养、转染及分组 胰腺泡AR42J细胞放入含有10%胎牛血清、青霉素及链霉素的RPMI1640培养液中培养，培养条件为37℃、5%CO2恒温培养箱，待细胞稳定传代2～3代后进行转染。收集处于对数生长期AR42J细胞，胰蛋白酶消化细胞后接种于6孔板，转染前1 d更换不含血清的RPMI1640培养基，不含血清的RPMI1640培养基分别稀释Lipofectamine2000转染试剂、anti-miR-NC、anti-miR-375、miR-NC、miR-375、si-NC、si-PIAS1，最终促使其终浓度为100 nmol/L的转染混合液，将anti-miR-NC、anti-miR-375、miR-NC、miR-375分别转染至AR42J细胞，分别为anti-miR-NC组、anti-miR-375组、miR-NC组、miR-375组，同时将anti-miR-375与si-NC、si-PIAS1分别共转染至AR42J细胞，分别为anti-miR-375+si-NC组、anti-miR-375+si-PIAS1组。转染后放入37℃、5%CO2恒温培养箱，培养6 h后将培养基更换为RPMI1640完全培养基继续培养48 h。

1.2.2构建AP模型 造模前1 d将生长状态良好的AR42J细胞以每孔5.5×104个细胞的密度接种于6孔板，每孔加入RPMI1640完全培养基(1 ml/孔)，放入37℃、5%CO2恒温培养箱孵育24 h，加入10 nmol/L CAE处理细胞24 h〔8〕，振荡混匀，继续培养48 h后收集AR42J细胞，同时将CAE处理后的AR42J细胞作为AR42J+CAE组，未经CAE处理的AR42J细胞作为AR42J组。1.2.1各转染组转染后12 h，用浓度为10 nmol/L的CAE刺激细胞24 h，继续培养48 h后收集细胞进行后续研究。

1.2.3qRT-PCR实验 收集各组AR42J细胞置于1.5 ml离心管内，经低温快速离心后弃上清，预冷磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤细胞，加入1 ml Trizol试剂提取细胞总RNA，应用NanoDrop2000测定RNA浓度，采用反转录试剂盒合成cDNA，以cDNA为模板进行qRT-PCR，反应体系为20 μl，SYBR Premix Ex Taq Ⅱ(2×)10 μl，cDNA 2 μl，上下游引物各0.8 μl，ddH2O补足至20 μl。扩增条件为95℃预变性5 min循环1次，95℃变性30 s循环35次，60℃退火30 s循环35次，72℃延伸30 s循环35次。miR-375以U6为内参基因，PIAS1以GAPDH为内参基因，采用2-ΔΔCt法计算miR-375、PIAS1 mRNA相对表达量。每组实验均设置3次重复。

1.2.4Western印迹 取对数生长期AR42J细胞，预冷PBS洗涤细胞，4℃，1 200 r/min转速离心5 min，离心半径 6 cm，离心后弃上清，加入RIPA细胞裂解液提取细胞总蛋白，二喹啉甲酸(BCA)法测定蛋白浓度，配置十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离胶与浓缩胶，将配置完成的SDS-PAGE凝胶放入含有1×蛋白电泳缓冲液的电泳槽内，蛋白样本上样(50 μg/孔)，电泳反应条件为分离胶前90 V 30 min，随后120 V 90 min，湿转膜仪将蛋白凝胶转移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，2 h后取膜置于5%脱脂奶粉封闭液内室温条件下封闭2 h，加入PIAS1、CyclinD1、P21、Bcl-2、Bax蛋白(稀释比均为1∶500)及GAPDH一抗(稀释比1∶1 000)，4℃条件下孵育过夜，次日用TBST洗涤3次×10 min，加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的IgG二抗(稀释比1∶5 000)，室温条件下孵育60 min，TBST洗涤3次×10 min，滴加ECL试剂显影，置于凝胶成像分析系统曝光并扫描图片，应用Quantity One软件分析蛋白条带灰度值，各蛋白均以GAPDH为内参进行半定量分析。每组实验均设置3次重复。

1.2.5细胞增殖实验 取各组对数生长期AR42J细胞，以每孔3×104个细胞的密度接种于96孔板，加入适量RPMI1640完全培养基，培养时间为24 h、48 h、72 h时向每孔加入质量浓度为5 g/L的MTT溶液20 μl，放入37℃、 5%CO2培养箱内继续培养4 h，更换培养基，每孔加入150 μl的二甲基亚砜(DMSO)溶液，置于摇床内振荡混匀，应用酶标仪检测各孔在490 nm处的光密度值(OD)。

1.2.6流式细胞议检测细胞凋亡 取1.2.1与1.2.2中各组对数生长期的AR42J细胞，加入100 μl结合缓冲液重悬细胞，加入5 μl Annexin V-FITC，室温条件下避光孵育15 min，加入5 μl PI染色液，避光振荡10 min充分混匀，加入400 μl结合缓冲液，充分混匀，置于流式细胞仪检测AR42J细胞凋亡率。

1.2.7双荧光素酶报告基因实验 利用TargetScan 靶基因预测库预测miR-375的靶基因，将含有miR-375与PIAS1 3′UTR的结合位点序列的PCR扩增产物载入pGL3质粒的Xbal酶切位点构建pGL3-WT-PIAS1野生型报告基因质粒，应用Gene TailorTMSite-Directed Mutagenesis System试剂盒突变miR-375与PIAS1 3′UTR的结合位点，构建pGL3-MUT-PIAS1突变型真核表达载体。取AR42J细胞分别转染后分为4组：miR-NC组(转染野生型WT-PIAS1质粒与miR-NC)；miR-375组(转染野生型WT-PIAS1质粒与miR-375 mimics)；miR-NC组(转染野生型MUT-PIAS1质粒与miR-NC)；miR-375组(转染野生型MUT-PIAS1质粒与miR-375 mimics)。细胞转染24 h后用双荧光素酶报告基因检测系统检测各组细胞荧光素酶活性。

1.3统计学方法 应用SPSS21.0软件进行t检验、单因素方差分析。

2 结 果

2.1miR-375、PIAS1在胰腺腺泡细胞AR42J和CAE作用的AR42J细胞中的表达 AR42J+CAE组miR-375明显高于AR42J组，而PIAS1蛋白水平明显低于AR42J组(均P<0.05)，见图1、表1。表明CAE可促使AR42J细胞中miR-375的表达上调，而抑制PIAS1表达。

图1 PIAS1蛋白的表达

表1 miR-375、JAK2在胰腺腺泡细胞AR42J和CAE作用的AR42J细胞中的表达

2.2抑制miR-375对CAE作用的AR42J细胞增殖的影响 通过向AR42J细胞中转染anti-miR-375及其阴性对照，并用CAE刺激后构建AP模型，用qRT-PCR实验检测转染效率，结果显示，anti-miR-375组AR42J细胞中miR-375的表达水平显著低于anti-miR-NC组(P<0.05)，表明转染成功。MTT实验检测细胞增殖，与anti-miR-NC组比较，anti-miR-375组AR42J细胞增殖活性均明显增强(均P<0.05)。表明抑制miR-375表达可有效促进AR42J细胞增殖。Western印迹检测细胞增殖相关蛋白表达，anti-miR-375组AR42J细胞中CyclinD1表达水平较anti-miR-NC组显著升高(P<0.05)，而P21表达水平明显降低(P<0.05)。见图2、表2。表明抑制miR-375表达可通过上调CyclinD1表达及下调P21表达进而促进AR42J细胞增殖。

图2 增殖相关蛋白的表达

2.3抑制miR-375对CAE作用的AR42J细胞凋亡的影响 流式细胞仪检测AR42J细胞凋亡，结果显示，anti-miR-375组细胞凋亡率明显低于anti-miR-NC组(P<0.05)。表明抑制miR-375表达可抑制AR42J细胞凋亡。Western印迹检测细胞凋亡相关蛋白表达，结果显示，与anti-miR-NC组比较，anti-miR-375组AR42J细胞中Bcl-2表达水平显著升高，而Bax表达水平显著降低(均P<0.05)。表明抑制miR-375表达可通过上调Bcl-2表达及下调Bax表达进而抑制AR42J细胞凋亡。见图3、表3。

A：抑制miR-375对CAE作用的AR42J细胞凋亡的影响；B：抑制miR-375对CAE作用的AR42J细胞凋亡蛋白表达的影响图3 抑制miR-375对CAE作用的AR42J细胞凋亡的影响

表3 抑制miR-375对CAE作用的AR42J细胞凋亡的影响

2.4miR-375靶向、调控PIAS1 TargetScan靶基因预测数据库对miR-375的靶基因进行预测，检索结果发现miR-375与PIAS1的3′UTR序列存在结合位点，见图4。双荧光素酶报告基因实验显示共转染miR-375 mimics、野生型WT-PIAS1载体的实验组中，miR-375组WT-PIAS1显著低于miR-NC组(P<0.05)，两组MUT-PIAS1比较，差异无统计学意义(P>0.05)，见表4。表明miR-375可直接靶向PIAS1。进一步研究结果显示，miR-375组PIAS1 mRNA及蛋白的表达水平显著低于miR-NC组(P<0.05)，anti-miR-375组PIAS1 mRNA及蛋白的表达水平显著高于anti-miR-NC组(P<0.05)，见图5、表5。表明miR-375可靶向调控PIAS1的表达。

图4 PIAS1的3′UTR含有miR-375的互补序列

表4 双荧光素酶报告实验

图5 miR-375调控PIAS1的表达

表5 miR-375调控PIAS1的表达

2.5抑制PIAS1表达能逆转抑制miR-375对CAE作用的AR42J细胞增殖的促进作用 为明确抑制miR-375表达是否通过上调PIAS1表达进而促进CAE作用的AR42J细胞增殖，通过回复实验将anti-miR-375与si-PIAS1共转染AR42J细胞，Western印迹结果显示anti-miR-375+si-PIAS1组PIAS1蛋白及细胞活性均显著低于anti-miR-375+si-NC组(均P<0.05)，而P21蛋白显著高于anti-miR-375+si-NC组(P<0.05)。见图6、表6。表明抑制PIAS1表达可逆转抑制miR-375对AR42J细胞增殖的促进作用。

1～4:anti-miR-NC组、anti-miR-375组、anti-miR-375+si-NC组、anti-miR-375+si-PIASI组；图7同图6 抑制PIAS1表达能逆转抑制miR-375对CAE作用的AR42J细胞增殖相关蛋白的表达

2.6抑制PIAS1表达能逆转抑制miR-375对CAE作用的AR42J细胞凋亡的抑制作用 流式细胞仪检测共转染anti-miR-375与si-PIAS1后AR42J细胞凋亡情况，结果显示，与anti-miR-375+si-NC组比较，anti-miR-375+si-PIAS1组AR42J细胞凋亡率明显升高(P<0.05)，Bcl-2蛋白表达水平显著降低(P<0.05)，而Bax蛋白表达水平显著升高(P<0.05)，见图7、表7。表明抑制PIAS1表达可逆转抑制miR-375对AR42J细胞凋亡的抑制作用。

图7 抑制PIAS1表达能逆转抑制miR-375对CAE作用的AR42J细胞凋亡蛋白的表达

表7 抑制PIAS1表达能逆转抑制miR-375对CAE作用的AR42J细胞凋亡的抑制作用

3 讨 论

AP发病机制涉及多层面、多阶段及多基因等调控过程导致临床尚无有效治疗手段，研究过程中采用来自大鼠胰腺腺泡细胞瘤的AR42J细胞进行研究，相关报道指出AR42J细胞具有易培养、转染效率高及CAE刺激反应大等优点〔9，10〕。因而本研究采用AR42J细胞构建AP模型。相关研究〔11〕表明miRNA表达异常与AP发生及发展密切相关。但miRNA与AP发生机制的内在联系尚未完全阐明，因此本研究进一步探讨miRNA与AP发生及发展的关系，以期进一步揭示AP发病机制。

miR-375表达水平升高可提高内质网氧化应激水平进而促使胰岛β细胞凋亡导致2型糖尿病病情加重〔12〕。研究〔13，14〕表明miR-375是胰腺发育过程中特异性表达的miRNA分子之一，其表达水平与胰腺形态及功能维持密切相关，通过抑制miR-375表达可抑制糖尿病胰岛β细胞凋亡进而达到治疗糖尿病目的。李鸿翔等〔15〕研究表明miR-375可作为致病因素促进高血压颈动脉斑块阳性疾病发生及发展过程。抑制miR-375表达可通过调控PDK-1-AKT信号通路进而减弱心肌梗死后的炎症反应及左心室功能障碍〔16〕。本研究结果说明miR-375可能在AP发生过程中发挥促进作用。进一步研究发现抑制miR-375后CAE作用的AR42J细胞增殖活性明显增强，而细胞凋亡率明显降低，并可明显促进CyclinD1、Bcl-2表达，而抑制p21、Bax表达，其中CyclinD1可促进细胞周期进入S期进而调控细胞周期增殖，p21可抑制CyclinD1表达进而诱导细胞周期停滞于S期〔17〕。细胞凋亡是炎性反应等生理或病理条件下激活膜信号系统进而激活内源性DNA内切酶活性导致其自然死亡，而Bcl-2、Bax通常是调节细胞凋亡的主要因子，其中Bcl-2可抑制细胞凋亡，而Bax可促进细胞凋亡〔18〕。由此可知，抑制miR-375表达可通过调控细胞增殖及凋亡相关蛋白表达进而促进CAE作用的AR42J细胞增殖及抑制细胞凋亡。

PIAS1具有明显抗炎作用，研究〔19〕表明PIAS1可通过抑制炎症微环境下胃癌细胞发生的上皮-间质细胞转化进程进而抑制肿瘤细胞迁移及侵袭。Janus激酶/信号转导与转录激活子(STAT)信号转导途径激活与AP炎症细胞过度激活密切相关，并可诱导AP促炎介质聚集进而加重AP疾病严重程度〔20〕。因而抑制JAK/STAT信号转导途径激活可有效控制AP炎症反应。进一步研究表明PIAS1是JAK/STAT信号转导途径的负向调控因子，其可有效抑制其活化进程〔21，22〕。与上述研究结果相似，本研究结果表明CAE作用的AR42J细胞中PIAS1的表达水平明显降低，AR42J细胞中miR-375与PIAS1呈负相关，由此推测miR-375是否为PIAS1的上游调控基因。通过靶基因预测软件分析显示miR-375与PIAS1存在结合位点，进一步采用双荧光素酶报告基因实验检测证实PIAS1是miR-375的靶基因，同时通过qRT-PCR与Western印迹验证miR-375与PIAS1的调控关系，结果表明miR-375可负性调控PIAS1的表达。为验证miR-375是否可通过靶向调控PIAS1表达进而参与AP发生及发展过程，本研究提示抑制miR-375可通过上调PIAS1表达进而抑制CAE作用的AR42J细胞凋亡并促进细胞增殖进而减缓疾病进展。