耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌耐药机制的研究进展

禹明均，郑小鹏，李春江

（1.佳木斯大学，黑龙江 佳木斯 154000；2.佳木斯大学附属第一医院 检验科，黑龙江 佳木斯 154000）

肺炎克雷伯菌（Klebsiella Pneumoniae，Kpn）是一种革兰氏阴性机会致病菌，主要在免疫功能低下的个体中引发疾病。此外，高毒性Kpn菌株会在健康个体中引发严重疾病，如支气管炎、败血症、腹膜炎等，而荚膜多糖（Capsule Polysacharides，CPS）作为高毒性Kpn的主要毒力决定因素，保护细胞免受免疫系统的杀菌活性。碳青霉烯类是治疗耐多药肠杆菌科重症感染最有效、最可靠的β-内酰胺类药物。近年来，碳青霉烯类药物被认为是治疗耐药革兰氏阴性细菌感染的最后一道防线。然而，随着碳青霉烯类抗生素的广泛应用，出现了许多对碳青霉烯类抗生素耐药的细菌，耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌（Carbapenem-Resistant Klebsiella Pneumoniae，CRKP）就是其中之一。本研究主要综述CRKP耐药机制的研究进展。

1 Kpn的耐药现状

碳青霉烯酶的产生是全世界Kpn中碳青霉烯耐药最常见的机制。分子诊断方法证实了绝大多数CRKP分离株携带碳青霉烯酶基因，如Kpn碳青霉烯酶或β-内酰胺酶基因。虽然这些分离株的碳青霉烯耐药性（Carbapenem Resistance，CR）差异很大，但碳青霉烯酶基因的存在的确预示了表型碳青霉烯的耐药性。CR的这种变异可能由其他基因型因素驱动，这也有助于碳青霉烯酶和非碳青霉烯酶产生耐碳青霉烯肠杆菌（Carbapenem Resistant Enterobacteriaceae，CRE）的CR。CRKP中观察到的一些基因型变异，如碳青霉烯酶基因拷贝数的变化或转座子亚型和启动子区域的变化[1]，改变了碳青霉烯酶基因的表达水平，这可能解释了碳青霉烯酶耐药性中的某些变异。其他与碳青霉烯酶表达不相关的因素也可能增强碳青霉烯酶的耐药性，包括扩展谱β-内酰胺酶的表达，这可能与孔蛋白缺失引起的碳青霉烯膜通透性降低有关。

2 CRKP的耐药机制

目前，全球CRKP感染不断增加，临床上有限的治疗方式已不能满足患者的需求。此外，CRKP通常会引起医院感染，与碳青霉烯敏感的Kpn引起的感染相比，CRKP感染的患者死亡率更高，探究CRKP的耐药机制迫在眉睫，以期为临床指导用药提供有效的理论依据。目前，已发现的Kpn对碳青霉烯类抗菌药物的耐药机制有5种：（1）产碳青霉烯酶，水解碳青霉烯类药物，是产生耐药性的主要机制；（2）高水平产头孢菌素酶（Axiomatic Multi-Platform C，AmpC）/超广谱β-内酰胺酶（Extended Spectrum Beta-Lactamases，ESBLs）同时合并外膜孔蛋白（Outer Membrane Protein，OMP）缺失或表达量不足；（3）高亲和位点青霉素结合蛋白（Penicillin Binding Proteins，PBPs）的数量不足或亲和力下降；（4）主动外排泵系统；（5）形成生物被膜[2]。

2.1 产碳青霉烯酶

β-内酰胺酶的命名最初基于氨基酸序列被定义为Ambler分类，将β-内酰胺酶分为4个主要类别：A、B、C、D[3]。其中，包含碳青霉烯酶的A、B、D是Kpn耐碳青霉烯类抗菌药物的主要机制。

2.1.1 A类

A类即非金属β-内酰胺酶，可以水解碳青霉烯类、头孢菌素、青霉素和氨曲南，标志着β-内酰胺酶活性从主要针对青霉素和头孢菌素的酶进化为水解碳青霉烯类的酶。A类丝氨酸碳青霉烯酶的代表包括酶NMC-A、IMI、SME和肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶（Klebsiella Pneumoniae Carbapenemase，KPC）。KPC已成为A类丝氨酸碳青霉烯酶中人们最熟悉的酶，多在肠杆菌科中被检测到，对所有β-内酰胺类（不包括碳青霉烯类和单内酰胺类）有耐药性。携带KPC基因的革兰氏阴性菌可以携带在移动遗传元件上，如转座子（Tn4401b）和多种质粒（IncFII、IncL/M和IncN）。表达KPC基因的生物体通常同时对其他类别的抗生素（如喹诺酮类和氨基糖苷类）具有耐药性。KPC-2生产者引起的CRKP感染率更高，其中，ST11是最常见的谱系。

2.1.2 B类

B类即金属β-内酰胺酶（Metallo Beta Lactamases，MBL），已从不动杆菌属和假单胞菌属中分离出来，并逐渐与肠杆菌属成员关联，Kpn、催产杆菌、大肠埃希菌和肠杆菌属MBL通常与维罗纳整合子编码的金属β-内酰胺酶、假单胞菌型和新德里MBL相关[4]。MBL通常由整合子、质粒和转座子等移动遗传元件表达，这些因素促进了MBL的传播。MBL可有效地水解β-内酰胺酶，并且不受β-内酰胺酶抑制剂（克拉维酸、他唑巴坦）的抑制。它们也不同于KPC，因为它们含有二价锌离子，可在活性位点通过协调组氨酸/胞嘧啶/天冬酰胺残基并激活结合的水/氢氧化物分子对易裂解酰胺的羰基碳进行亲核攻击来参与反应。MBL已在不同国家被确定为Kpn医院暴发的来源。

2.1.3 D类

D类即β-内酰胺酶，由于其对β-内酰胺的水解活性，最初被定性为苯唑西林酶，最近已成为临床关注的问题。D类β-内酰胺酶和邻氯青霉素（Cloxacillin，OXA）变体具有可变但显著的碳青霉烯酶活性，通常不被克拉维酸、他唑巴坦和舒巴坦抑制（例外：OXA-2和OXA-32被他唑巴坦抑制但不被舒巴坦和克拉维酸抑制，OXA-53被克拉维酸抑制）[5]。近1/3的OXA变体水解碳青霉烯类。产OXA-48 Kpn的最初病例表现为高度耐药菌株，因为它表达其他β-内酰胺酶（A类ESBLs SHV-2a、窄谱内酰胺酶TEM 1和OXA-47）[6]。虽然OXA-48是已知的对亚胺培南具有最高催化效率的β-内酰胺酶，但含有质粒介导的blaOXA-4基因的生物体可有效水解青霉素，而水解碳青霉烯类的水平较低，对超广谱头孢菌素的活性较弱，对头孢他啶和头孢吡肟的水解活性较差。OXA-163的序列与OXA-48的序列相比，缺少4个氨基酸，对应OXA-48序列的位置DBL222至DBL225。目前，已有200多种OXA酶被报道，在Kpn中，OXA-48最常见。

2.2 高产AmpC/ESBLs酶合并OMP缺失或表达量不足

2.2.1 AmpC酶

AmpC β-内酰胺酶是一种由革兰氏阴性菌产生的酶，可以水解广谱β-内酰胺抗生素，包括氨基青霉素和第一、第二以及第三代头孢菌素，常见基因型包括blaACC、blaCIT、blaEBC、blaFOX、blaMOX和blaDHAgenes 6个家族[7]。在某些物种中，AmpC β-内酰胺酶位于染色体和质粒上。AmpC染色体基因向质粒转移产生pAmpC，赋予其耐药性[8]。pAmpC相关耐药性的流行率低于ESBLs。

2.2.2 ESBLs

近30年，临床肠杆菌科分离株中的ESBLs显著增加。近20年，CTX-M取代SHV，成为全球传播的主要ESBL类型。亚洲、拉丁美洲和欧洲的研究显示，大肠埃希菌和克雷伯菌对头孢菌素的耐药性急剧增加，这在很大程度上取决于CTX-M型ESBL的传播[9]。在我国，blaCTX-M-14被确定为最常见的ESBL基因。有人提出，blaCTX-M的质粒是产生CTX-M的肠杆菌科细菌增加的主要原因。blaCTX-M基因被发现与某些复制子类型的质粒相关，主要包括IncF、IncI1、IncN、IncHI2、IncL/M和IncK。其中，IncF被认为在blaCTX-M-15基因的传播中起重要作用，而IncF、IncK和IncI1在很大程度上有助于blaCTX-M-14基因的传播。blaCTX-M-3基因主要包含在IncL/M和IncI1质粒中，blaCTX-M-9基因主要包含在IncHI2质粒中。医院感染监测系统报告称，第三代头孢菌素的耐药性在5年内提高了47%，ESBL的产生在其中起到了至关重要的作用。

2.2.3 OMP缺失或表达下降

在革兰氏阴性菌中，OMP充当调节细胞外和细胞内物质（如铁、营养素和抗生素）交换的通道。在临床分离株中经常发现OMP丢失，尤其在产ESBLs的肠杆菌科中。Kpn包含不同的OMP（OmpK35、36和37）。有报道称，在Kpn中，两种主要孔蛋白OmpK35和OmpK36的缺失或表达减少与广泛的抗菌素耐药性有关。在产AmpC β-内酰胺酶的Kpn中，OmpK35和OmpK36双重缺失的后果是产生对亚胺培南的广泛耐药性[10]。也有学者认为，Kpn的CR也归因于孔蛋白丢失和AmpC产生的共同作用，仅这些蛋白质中的缺陷不一定会导致临床上的抗生素耐药性[11]。

2.3 PBPs位点缺失或数量下降

PBPs是细菌中所有β-内酰胺类抗生素的高亲和力靶点。众所周知，所有β-内酰胺类都有相同的作用方式：它们通过充当PBP转肽酶结构域的底物来抑制细菌细胞壁合成，与PBP的活性位点丝氨酸残基形成稳定的共价复合物。传统上，PBPs被划分为高分子质量PBPs（HMW-PBPs，包括A和B）以及低分子质量PBPs（LMW-PBPs），HMW-PBPs对细胞存活至关重要，并且是β-内酰胺的实际靶标。A类PBP催化聚糖链的形成，A类和B类PBP催化细胞质膜外侧肽聚糖干肽的交联，而LMW-PBPs的作用微乎其微。有报道称，肺炎链球菌对β-内酰胺的敏感性降低在很大程度上与PBP的序列变异相关，其中，PBP2在CRKP中最常见[12]。

2.4 主动外排泵

主动外排系统的过度表达对Kpn耐药性的产生也有不可忽视的作用。外排泵，尤其是多药外排，是药物治疗的主要关注点，因为它们可以排出多种具有临床意义的药物。外排泵在介导对多种药物和生物膜结构的抗性方面占主导地位[13]，其不仅将给定的抗生素挤出细菌细胞，还充当毒力因子，在感染期间赋予抗菌素耐药性。简言之，这些外排系统允许微生物通过排出有毒物质（例如代谢物、抗菌剂和毒力决定簇的群体感应调节表达）来平衡内部环境。到目前为止，acrAB、oqxAB和kexD外排系统与Kpn的抗生素耐药性有关。除了acrAB、kexD、kdeA、kmrA、kpnEF和oqxAB，EefAB、ketM和CepA等少数其他外排基因也在Kpn中被报道。

2.5 生物膜

生物膜是生活在由多糖、蛋白质和细胞外DNA组成的高度水合基质中的细菌群落，这种生活方式赋予细菌许多优势（包括抵御外部威胁）。然而，它们也有助于提高细菌对抗菌素的耐药性。据报道，19世纪80年代以来，Kpn能在体外作为生物膜生长。Kpn的耐药性与生物膜形成能力之间存在一定的相关性已被证实。有研究表明，氨苄西林不能穿透野生型Kpn生物膜，而环丙沙星和非反应性示踪剂（氯离子）可快速穿透生物膜。氨苄西林只有在由缺乏β-内酰胺酶的突变体形成时才能穿透生物膜，证明野生型和突变型Kpn生物膜对氨苄西林和环丙沙星的耐药性提高并非由扩散缓慢所致。此外，也有研究证明，聚-b-连接的N-乙酰氨基葡萄糖可以介导生物膜的形成并发挥一定的作用。

3 结语

Kpn作为一种机会致病菌，是泌尿、呼吸道和血液感染的主要原因之一。近年来，由于抗生素的广泛应用，Kpn的多重耐药性也随之出现。CRKP感染患者的死亡率较高，如何处理CRKP是临床上亟待解决的重要问题，开展CRKP对碳青霉烯类耐药机制的研究、寻找有效的治疗策略势在必行。