脑铁沉积动物模型的研究进展

黄一羚,罗嘉强,彭鹏

(广西医科大学第一附属医院放射科, 南宁 530021)

铁是大脑中含量最丰富的微量金属元素之一。与所有细胞一样,神经元和胶质细胞在其生理学的许多方面都需要铁,包括电子传递、还原型辅酶II(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate,NADPH)活性、轴突髓鞘形成,以及作为参与神经递质合成的几种酶的辅助因子[1]。正常情况下,机体内铁主要来源于膳食以及从衰老红细胞中回收[2],由于人体缺乏排泄过多铁的机制,使得脑铁浓度随着年龄逐渐增加(生理性)。

研究表明某些血液病或神经退行性疾病的患者大脑存在铁沉积,如地中海贫血[3-4]、帕金森病(Parkinson’s disease,PD)、阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)、Friedreich共济失调症、神经铁蛋白病、多发性硬化、亨廷顿病(Huntington disease,HD)等[5-7]。但到目前为止,脑铁沉积定量的准确性、铁沉积引起脑功能紊乱的原因及发病机制尚不十分明确,临床对这类疾病尚无有效治愈手段。因此,建立脑铁沉积动物模型是解决以上问题不可或缺的重要环节。

1 脑铁沉积的机制

正常情况下,哺乳动物大脑中的铁稳态受到严格调节,它依赖于血—脑脊液屏障(blood-brain barrier,BBB)和许多参与血液循环铁运输的分子[8]。目前,铁如何通过血脑屏障尚不十分清楚,但有研究表明,转铁蛋白-转铁蛋白受体(transferrin/transferrin receptor,Tf/TfR)途径是铁跨越脑毛细血管内皮管腔膜的主要途径[9],当铁通过血脑屏障后,经转铁蛋白结合铁(transferrin-bound iron,Tf-Fe)和非转铁蛋白结合铁(non-transferrinboundiron,NTBI)两种转运形式被脑细胞摄取[10]。

由于每天从饮食中摄入的铁量(1 ~ 2 mg)相当于通过消化、皮肤和尿路等排出的铁量[11],且体内红细胞衰老和破坏不断释放铁,因此,随着年龄的增长,铁逐渐在大脑中沉积,尤其是在皮质、苍白球、红核、齿状核、尾状核和黑质中[7,12]。在脑铁沉积疾病中,不同疾病的铁沉积方式可能不同,如帕金森病可能与DMT1表达增加[13-14]、乳铁蛋白受体(LfR)表达增加[15]有关;多发性硬化症可能与炎症过程[16]有关;而铁蛋白病可能与铁蛋白轻链基因突变[17-19]有关。

大量证据表明PD患者几种铁转运蛋白的失调(负责铁的流入/吸收或流出/释放)导致异常铁沉积[20]。有研究报道,PD患者黑质中二价金属转运蛋白1(recombinant divalent metal transporter 1,DMT1)[13-14]和脑内乳铁蛋白受体(lactoferrin receptor,LfR)[21]表达增加促进了神经元内铁沉积以及黑质内多巴胺能神经元变性。此外,PD患者血脑血管系统中LfR表达增高,可能与PD患者血脑屏障的改变有关[21]。在生理条件下,过氧化-抗氧化系统处于平衡状态[22]。当脑内发生铁沉积,过多的游离铁诱导氧化应激,可导致神经元过氧化损伤、变性甚至死亡,这是诱发神经退行性疾病的重要原因之一[5]。

2 脑铁沉积动物模型的建立

2.1 实验动物选择

动物与人类不同,有些可以排出体内过多的铁,因此选择的实验动物应与人体生理机制类似,同时遵循3R原则。由于人类和其他哺乳动物缺乏控制铁排泄的机制[23],故在建立脑铁沉积模型时,鼠、恒河猴模型均有报道,但研究者采用鼠模型较为多见。由于建立模型方法不同,鼠的品种选择往往不一。

如在应用腹腔注射铁剂或羰基铁饮食时,研究者使用SD大鼠[1,24]、ICR小鼠[25]较多,原因可能是SD大鼠与ICR小鼠属于封闭群,具有类似于人类群体遗传异质性遗传组成,在人类遗传研究、药物筛选和毒性实验等方面起着不可替代的作用[26]。此外,SD大鼠还具有对疾病抵抗力强的特点,在药理学研究如药物排泄速率、蓄积倾向等方面应用广泛[27]。而使用基因敲除法时,研究者多采用C57BL/6小鼠[28-30],原因可能是C57BL/6小鼠属于近交系,具有基因纯合、遗传稳定、表现型均一[27]等特性。

2.2 铁剂选择

在目前铁沉积模型研究中,注射用铁剂有:右旋糖酐铁、超微超顺磁性氧化铁纳米颗粒(ultramicro superparamagnetic iron oxide nanoparticle,USPIO)、蔗糖铁等。与蔗糖铁比,右旋糖酐铁稳定性较好,但氧化应激水平较高[31]。此外,右旋糖酐铁还具有低毒性和肌肉吸收方面性质独特的特点[32]。

据文献报道,在建立脑铁沉积模型时,Gong等[1]、赵晋英等[25]多采用右旋糖酐铁。也有研究者应用蔗糖铁建立铁过载大鼠模型,但在该研究中实验组大鼠脑组织中并未发现铁沉积,故而推测铁-蔗糖复合物无法穿透血脑屏障[33]。蔗糖铁虽然在脑铁沉积模型建立方面应用较少,但也有其独特之处。Italia等[32]对BALB/c小鼠腹腔注射蔗糖铁,研究表明这种给药方式与β地中海贫血患者的输血铁超载途径非常相似。USPIO是水动力学粒径小于40 nm[34]的超顺磁性氧化铁纳米粒子。Fujiwara等[35]发现USPIO也可应用于脑铁沉积模型的建立中。但由于其颗粒小,可通过毛细血管壁、血浆半衰期长等特点,更多应用于中枢神经系统的诊断、治疗、药物运输及探测等方面。因此,在建立不同疾病动物模型时,可根据实际需要选择最适合的铁剂以更符合疾病的发病机制。

2.3 脑铁沉积模型建立方法

2.3.1 注射铁剂法

腹腔[1,25]或肌肉[36-38]注射铁剂是建立铁沉积动物模型的主要方法,具有操作简单、成功率高等优点。此外,还有较为少用的静脉注射法。但在建立动物脑铁沉积模型时,由于研究者普遍采用鼠模型,故更偏向于采用腹腔注射。其原因可能有以下几点:(1)肌肉注射相对于腹腔注射,吸收速度较慢;(2)肌肉注射可能会引起注射部位肌肉痉挛或坏死;(3)静脉注射操作困难,铁剂生物利用度高,容易造成肝、心脏铁过载导致实验动物死亡。

有研究通过给SD大鼠每隔1 d腹腔注射右旋糖酐铁100 mg,共注射3 d,每只大鼠共注射300 mg铁[1]。经原子吸收分光光度计测量总铁表明,铁过载组大鼠大脑中皮质、纹状体、黑质、海马4个部位的铁含量显著增加,病理检查也得出了类似的结果。赵晋英等[25]通过给小鼠腹膜腔注射右旋糖酐铁每次10 mg,隔日注射1次,共28 d,结果显示铁过载小鼠大脑纹状体、脉络丛上皮细胞、软脑膜和脑血管铁染色明显增强。Fujiwara等[35]给恒河猴静脉注射USPIO造影剂4次(每15 min 2.5 mg/kg),累计剂量为10 mg/kg,结果显示黑质、苍白球、丘脑、皮层铁含量显著增加。

2.3.2 羰基铁饮食法

羰基铁饮食法是给实验动物喂养含有一定量羰基铁的饲料造成脑铁过载。虽然该方法操作简单、动物死亡率低,但对于建立脑铁沉积动物模型来说,造模周期较长。

据文献报道,羰基铁饮食法一般多用于肝铁沉积动物模型的建立,在脑铁沉积模型中应用较少。Chang等[24]在建立脑铁过载模型时将大鼠分成3组,对照组喂食基础纯净膳食(含铁60 mg/kg)、高铁组喂食添加2.5%羰基铁的基础纯净膳食、低铁组喂食低铁纯净膳食(含铁10 mg/kg),共6周。结果显示在皮质、海马、纹状体和黑质4个脑区中,与对照组相比,低铁组大鼠脑铁浓度显著降低,高铁组大鼠铁浓度明显升高。

由于肠道从食物中吸收的铁较少,因此在建立脑铁沉积动物模型的方法中,采用羰基铁饮食方法相对于注射的铁剂的方法成模过程非常缓慢。为了造模成功,建议研究者在进行造模时应设立多个铁浓度的羰基铁饮食,在保证实验动物不因肝、心脏等器官发生严重铁过载导致死亡的前提下,选择最佳的羰基铁饮食,并合理延长造模时间,使目标器官出现铁过载。

2.3.3 基因敲除法

基因敲除法是将Cp、Heph、IRP2等与铁代谢相关基因敲除,使体内铁代谢紊乱从而得到脑铁沉积模型的方法。该方法实验操作复杂,技术要求及动物死亡率高,多用于研究某些特定基因。

如Jiang等[28]为研究亚铁氧化酶(Heph)和铜蓝蛋白(CP)在中枢神经系统铁代谢和体内铁平衡中的作用,选取亚铁氧化酶基因敲除(Heph-KO)、铜蓝蛋白基因敲除(Cp-KO)小鼠和野生型(wild type,WT)小鼠进行实验,测量3个不同年龄组Heph-KO、Cp-KO和WT小鼠的大脑铁浓度。研究结果显示,在4周龄和8周龄的幼鼠中,所检查的大脑区域铁浓度没有显著差异,而在6 ~ 7个月大时,与WT和Cp-KO组小鼠相比,Heph-KO组小鼠的皮质、海马、脑干和小脑中的铁浓度显著升高,表现出铁蓄积,同时铁蛋白水平也增加。这表明在Heph-KO小鼠的大脑中,铁会随着年龄的增长而增加且更易发生脑铁过载。此外,还有研究表明与单独敲除Cp或Heph基因相比,同时敲除小鼠的Cp和Heph基因会使小鼠的脑铁积累加速,且具有显著铁积累的区域为黑质(substantianigra,SN)和小脑[29]。

在研究帕金森的发病原因时,Ci等[30]使用了IRP2基因敲除的小鼠进行实验,研究结果表明与WT小鼠相比,IRP2基因缺失诱导了黑质中的铁积累,并加剧了神经元凋亡和帕金森病症状。

地中海贫血是一种由于β-珠蛋白生成障碍导致血红蛋白生成减少的遗传溶血性疾病,在建立地中海贫血脑铁沉积动物模型时,Yatmark等[39]将小鼠β-珠蛋白基因敲除,使小鼠出现与人类地中海贫血相似的病理和临床症状,随后对小鼠腹腔注射每只20 mg右旋糖酐铁,为期5 d,总铁剂量为100 mg。研究结果显示,与对照组相比,铁超载组小鼠脑铁浓度明显增加。

由此可知,在建立不同疾病所致脑铁沉积模型时,应根据需要敲除不同基因,使动物模型的表现与人类疾病更加相符,从而更有利于某一特定疾病的研究。

3 脑铁沉积模型的应用

3.1 铁代谢相关分子与基因的研究

研究者建立脑铁沉积模型多用于探讨与铁代谢有关的分子与基因,如铁调素、Cp、Heph、IRP2等。Gong等[1]利用大鼠脑铁沉积模型证实铁调素可防止大脑中的铁积累及铁诱导的氧化应激,推测铁调素可能在阻断神经退行性疾病病理过程中具有巨大潜力。Jiang等[28]证实,在6 ~ 7个月时,与WT和Cp-KO组小鼠比,Heph-KO组小鼠的皮质、海马、脑干和小脑中的铁浓度显著升高,表现出铁蓄积,同时铁蛋白水平也增加,而Cp KO小鼠在12个月时,大脑铁的积累才会随着年龄的增长而增加。

3.2 脑铁沉积疾病及定量方法的研究

准确定量脑铁沉积对于脑铁沉积疾病诊断及治疗至关重要。在研究IRP2基因敲除引起的铁超载对帕金森病症状的影响时,Ci等[30]发现小鼠IRP2基因敲除可以导致黑质铁超载和星形胶质细胞铁代谢改变,从而引起帕金森氏症状加重。Yatmark等[39]建立β型地中海贫血小鼠脑铁超载模型并结合磁共振成像(magnetic resonance imaging,MRI)检查,研究结果显示与对照组相比铁超载小鼠大脑T2*值下降,并且病理证实存在铁沉积,从而证实MRI技术和T2*值对铁积累检测的有用性。Fujiwara等[35]则证实弥散MRI对组织中铁沉积很敏感,可以用来量化铁。

4 总结与展望

建立脑铁沉积模型时,根据疾病种类、研究目的,研究者选择的动物品种、造模方法、铁剂剂量往往不一(见表1)。对于动物品种的选择,腹腔注射或羰基铁饮食法多选择SD大鼠或ICR小鼠,而基因敲除多选择C57BL/6小鼠。由于动物品种不一,铁剂耐受程度不同,为避免实验过程中因剂量问题导致动物死亡,注射铁剂应在预实验期间设立多个剂量梯度,寻找最合适的剂量。羰基铁饮食法由于经肠道吸收,铁在脑内沉积的过程又非常缓慢,目前研究者多采用2.5%或3%羰基铁饮食进行造模。无论是注射铁剂还是羰基铁饮食,在造模过程中都可根据需要适当延长造模周期,以达到最佳效果。

表1 铁沉积动物模型Table 1 Animal model of iron deposition

目前,脑内铁沉积的诊断多依赖于MRI定量技术,但定量的准确性尚不十分明确。脑铁沉积动物模型的建立不仅能了解脑铁沉积引起的疾病发病机理、研究有效治愈手段,还有望进一步提高MRI定量脑铁沉积的准确性。