miR-145-4调控蛋鸭卵泡发育机制的研究

吴 艳，皮劲松，张 昊，梁振华，杜金平，潘爱銮，申 杰，蒲跃进

(1.湖北省农业科学院畜牧兽医研究所，武汉 430064；2.动物胚胎工程及分子育种湖北省重点实验室，武汉 430064)

卵泡发育与蛋鸭的产蛋性能密切相关，直接影响蛋鸭的产蛋量。颗粒细胞是卵泡中主要的功能细胞，其增殖分化或凋亡对卵泡发育具有重要的调控作用[1-2]。颗粒细胞可以调节垂体释放促卵泡素(FSH)来影响卵泡发育，也可作为局部调节因子调控类固醇激素生成和细胞增殖，由此可见，颗粒细胞是卵泡生长发育所必需的。禽类的卵泡在发育过程中大量发生闭锁，Johnson等[3]发现，鸡卵泡闭锁起始于颗粒层并受颗粒细胞凋亡过程的调节。

microRNA(miRNA)作为一类小的单链内源性非编码RNA[4]，根据与靶mRNA的互补程度，实现对靶mRNA的降解或翻译抑制[5]。miRNA参与卵泡发育的整个过程，包括卵泡生长、排卵及闭锁过程[6]，并且在卵泡发育的调控方面也发挥着重要作用。已有研究发现，许多miRNA参与调控畜禽卵泡颗粒细胞的增殖分化[7-11]。本课题组前期研究发现，miR-145-4可以靶向DNA损伤诱导转录因子3(DDIT3)调控蛋鸭卵泡发育[12]。目前关于miR-145-4在蛋鸭卵泡颗粒细胞中的功能及作用机制鲜见报道。因此，本研究以蛋鸭卵泡颗粒细胞为细胞模型，探究miR-145-4对蛋鸭卵泡颗粒细胞凋亡的调控作用和机制，以期为进一步完善miR-145-4在蛋鸭卵泡颗粒细胞中的调控作用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验动物 试验动物来自湖北省农业科学院畜牧兽医研究所家禽育种场。选取在相同条件下饲养的健康、处于产蛋高峰期(300日龄左右)的母鸭5～10只，用于颗粒细胞分离，并采集翅静脉血样0.5 mL，提取基因组DNA，-20 ℃保存备用。

1.1.2 主要试剂 DMEM基础培养基、含EDTA的胰酶稀释液、PBS缓冲液、胎牛血清、青霉素和链霉素均购自HyClone公司；Lipofectamine®3000转染试剂盒、Opti-MEM®试剂均购自Invitrogen；双荧光素酶检测试剂盒购自Promega公司；SYBR Green qPCR Mix、PmeⅠ和XhoⅠ限制性内切酶、T4 DNA连接酶均购自Thermo公司；KOD-FX酶购自TOYOBO公司；凝胶DNA小量回收试剂盒和无内毒素质粒抽提试剂盒均购自Omega公司；PrimeScriptTMRT Reagent Kit购自宝生物工程(大连)有限公司；荧光定量PCR酶购自Bio-Rad公司；pmirGLO载体为湖北省农业科学院畜牧兽医研究所家禽育种实验室保存；其余试剂均为国产分析纯。

1.2 方法

1.2.1 蛋鸭卵泡颗粒细胞分离培养 选择产蛋期蛋鸭，颈静脉放血后取整个卵巢组织，置于装有预冷PBS的无菌培养皿中迅速带回实验室，用加有双抗的PBS清洗数次。将漂洗干净的卵泡移入装有预冷PBS的平皿中，剥净卵泡外膜、结缔组织及血管网，划破卵泡后释放卵黄，将漂洗干净的卵泡膜尽量剪碎，置于15 mL离心管中，加4 mL培养基反复吹打1 min，4 ℃、1 000 r/min离心后弃上清；加入4 mL 0.2%Ⅱ型胶原酶，重悬沉淀，置于37 ℃恒温摇床80 r/min消化30 min，加入4 mL M199完全培养基(含10%血清)终止消化[13]；用200目不锈钢筛过滤，收集滤液，4 ℃、1 000 r/min离心10 min后收集细胞，加入M199完全培养基(含10% FBS及1%双抗)重悬，测定细胞密度后接种于6孔培养皿，置于37 ℃、5% CO2培养箱内静置培养24 h后可用于后续相关试验。

1.2.2 颗粒细胞转染 本课题组前期测序获得miR-145-4的序列为：5′-GUCCAGUUUUCCCAG-GAAUCCCUUA-3′(未发表),根据其序列设计其相似物(mimic)、抑制物(inhibitor)、mimic-NC和inhibitor-NC(表1)，序列均由广州锐博生物技术有限公司合成。 颗粒细胞培养48 h后，按照Lipofectamine®3000说明书转染终浓度为100 nm/μL的miR-145-4的mimic和inhibitor，对照组分别转染mimic-NC和inhibitor-NC。每个试验组设置3个重复，24 h后利用Trizol收集细胞样品。

1.2.3 实时荧光定量PCR检测基因相对表达量 利用TRizol试剂提取处理前后的卵泡颗粒细胞总RNA，使用PrimeScriptTMRT Reagent Kit进行反转录合成cDNA，利用荧光定量试剂盒SYBR Green qPCR Mix分别检测miR-145-4、增殖凋亡标志基因CyclinB2(登录号：XM_027467130)和BCL2(登录号：XM_027451679)以及miR-145-4靶基因PIK3CA(登录号：XM_027464233)的表达情况，引物见表1。引物均由武汉奥科鼎盛生物科技有限公司合成。各个基因的表达量计算分别以U6 和β-actin(登录号：NM_001310421)为内参基因。PCR反应体系20 μL：cDNA模板1 μL，SYBR Green qPCR Mix 10 μL，上、下游引物各1 μL，灭菌ddH2O补足20 μL。PCR反应条件:95 ℃预变性10 min；95 ℃变性10 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30s，共40个循环。

表1 miR-145-4相关序列及定量引物序列

续表

1.2.4 靶基因预测与载体构建 根据在线预测网站Targetscan (http:∥www.targetscan.org/vert_72/)和BiBiServ中的RNAHybrid (https:∥bibiserv.cebitec.uni-bielefeld.de/rnahybrid)进行miR-145-4的靶基因预测与结合位点分析。针对蛋鸭PIK3CA基因3′-UTR中与miR-145-4结合位点突变前后的序列，分别设计引物扩增突变前后PIK3CA基因3′-UTR片段，引物序列见表1。PCR反应体系20 μL：蛋鸭血液DNA模板1 μL，10×Buffer 10 μL，上、下游引物各1 μL，KOD-FX酶 1 μL，灭菌ddH2O补足体系。PCR反应条件为:95 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共35个循环；72 ℃延伸10 min。利用胶回收试剂盒对扩增产物进行切胶回收后和pmirGLO质粒进行双酶切，经过胶回收后连接，分别获得野生型(PIK3CA-wt)和突变型重组载体(PIK3CA-mut)，将构建的PIK3CA-wt和PIK3CA-mut载体送武汉奥科鼎盛生物科技有限公司测序，验证载体构建结果。

1.2.5 双荧光素酶报告实验检测荧光素酶活性 将pmirGLO、PIK3CA-wt和PIK3CA-mut载体分别与miR-145-4 mimic和mimic-NC共转染蛋鸭卵泡颗粒细胞。按照双荧光素酶活性检测试剂盒说明书进行，测定萤火虫荧光素酶(firefly luciferase，FL)和海肾荧光素酶(ranilla luciferase，RL)强度，根据FL/RL比值来判断相对荧光素酶活性。

1.3 数据分析

每个试验设3个重复，使用2-ΔΔCt法计算基因相对表达量[14]，采用SPSS 19.0软件进行结果统计分析，利用GraphPad Prism 6.0进行作图。两组样本平均值比较采用t检验，结果用平均值±标准差表示，P<0.05表示差异显著，P<0.01表示差异极显著。

2 结 果

2.1 miR-145-4对鸭颗粒细胞增殖凋亡的影响

利用合成的miR-145-4 mimic和inhibitor分别转染鸭卵泡颗粒细胞，采用实时荧光定量PCR检测miR-145-4及增殖凋亡关键基因CyclinB2和BCL2表达情况，结果见图1。由图1可知，过表达miR-145-4后，与对照组相比，miR-145-4表达量极显著升高(P<0.01)，细胞增殖标记基因CyclinB2表达量极显著降低(P<0.01)，细胞凋亡标志基因BCL2表达量极显著增加(P<0.01)；而抑制miR-145-4后，miR-145-4表达量极显著降低(P<0.01)，CyclinB2基因表达量极显著升高(P<0.01)、BCL2基因表达量极显著降低(P<0.01)，说明miR-145-4促进了蛋鸭卵泡颗粒细胞的凋亡。

①A，转染miR-145-4 mimic后miR-145-4的表达情况；B，转染miR-145-4 inhibitor后miR-145-4的表达情况；C，转染miR-145-4 mimic后CyclinB2和BCL2基因表达情况；D，转染miR-145-4 inhibitor后CyclinB2和BCL2基因表达情况。②*，差异显著(P<0.05)；**，差异极显著(P<0.01)。图5、6同①A，The expression of miR-145-4 after transfected miR-145-4 mimic;B，The expression of miR-145-4 after transfected miR-145-4 inhibitor;C，The expression of CyclinB2 and BCL2 genes after transfected miR-145-4 mimic;D，The expression of CyclinB2 and BCL2 genes after transfected miR-145-4 inhibitor.②*,Significant difference (P<0.05);**,Extremely significant difference (P<0.01).The same as fig.5 and fig.6图1 过表达和抑制表达miR-145-4后相关基因表达情况Fig.1 The expression of related genes after overexpression and inhibition of miR-145-4

2.2 miR-145-4靶基因预测与载体构建

通过Targetscan网站预测miR-145-4的靶基因，共预测到1 680个靶基因，从中挑选与细胞增殖凋亡相关的基因PIK3CA为靶基因。将PIK3CA基因3′-UTR序列和miR-145-4序列导入RNAHybrid网站中分析二者的结合位点，结果见图2。由图2可知，miR-145-4与PIK3CA基因的潜在结合位点位于208—232 bp之间。根据结合位点突变前后的序列分别构建野生型(PIK3CA-wt)和突变型(PIK3CA-mut)载体。对构建的野生型和突变型载体分别进行双酶切鉴定，结果显示野生型和突变型载体的PIK3CA目的片段长度为240 bp、载体长度为7 350 bp(图3)，与预期一致，说明质粒载体构建成功。对构建的野生型和突变型载体进行测序分析，结果显示野生型载体的序列与参考序列一致，突变型载体的序列，从GATTT突变为GCTCA(图4)，与预期结果一致，可用于后续研究。

2.3 miR-145-4与PIK3CA基因靶向结合关系验证

用pmirGLO、PIK3CA-wt、PIK3CA-mut分别与miR-145-4 mimic、miR-145-4 mimic-NC分别共转染鸭卵泡颗粒细胞，24 h后收集细胞检测荧光活性，结果见图5。 由图5可以看出，共转染miR-145-4 mimic和PIK3CA-wt载体后，与PIK3CA-mut及空载体共转染组相比，其双荧光素酶活性均极显著降低(P<0.01)，说明miR-145-4能够与PIK3CA基因3′-UTR结合。

图2 miR-145-4与PIK3CA基因的潜在结合位点预测结果Fig.2 Prediction results of potential binding sites between miR-145-4 and PIK3CA gene

M，DL5000 DNA Marker；1，PIK3CA-wt；2，PIK3CA-mut图3 野生型与突变型载体双酶切结果Fig.3 Electrophoresis results of wild and mutant type vector

图4 野生型与突变型载体测序结果Fig.4 The sequencing results of wild and mutant type vector

图5 miR-145-4与PIK3CA的3′-UTR结合关系的双荧光素酶验证结果Fig.5 Double luciferase verification results of the binding relationship between miR-145-4 and 3′-UTR of PIK3CA

2.4 miR-145-4对PIK3CA基因表达的影响

利用miR-145-4 mimic和inhibitor转染鸭颗粒细胞后，实时荧光定量PCR检测PIK3CA基因的表达变化，结果表明，与对照组相比，当过表达miR-145-4后，PIK3CA基因表达量显著降低(P<0.05)，而抑制miR-145-4后PIK3CA基因表达量极显著升高(P<0.01)(图6)。

图6 过表达和抑制表达miR-145-4后PIK3CA基因的相对表达量Fig.6 Relative expression of PIK3CA gene after overexpression and inhibition of miR-145-4

3 讨 论

miRNA是一类长度19～24 nt的非编码单链RNA，常通过碱基互补配对的方式与靶基因的3′-UTR部分或完全互补，剪切靶基因的转录产物或者抑制转录产物的翻译，从而起到转录后调控靶基因表达的作用。已有研究表明，miRNAs参与卵泡发育的整个过程，包括卵泡生长、排卵及闭锁过程[15]，并且在卵泡发育的调控方面也发挥着重要作用。Wu等[16]研究发现，miRNA-gga-miR-200a-3p在鸡的生殖调控中具有重要的作用。Kang等[17]研究发现，mir-26a-5p通过靶向TNRC5A基因促进鸡卵巢中卵泡膜细胞的增殖。而关于miRNA参与蛋鸭卵泡发育的研究报道较少，因此本试验开展了蛋鸭miRNA调控卵泡发育的相关研究。

已有研究表明，miR-145作为转录后调控mRNA表达的miRNA，抑制肺癌细胞、乳腺癌细胞及结肠癌细胞的增殖及血管生成[18]；通过降低基质金属蛋白酶2(MMP-2)、基质金属蛋白酶9(MMP-9)的表达抑制卵巢癌细胞的增殖、迁移,促进调亡[19]；通过靶向作用激活素受体IB抑制小鼠卵巢颗粒细胞增殖[20]等。 本研究结果显示，miR-145-4促进了蛋鸭卵泡颗粒细胞凋亡，说明miRNA对蛋鸭卵泡发育具有重要的调控作用。

经典的miRNA作用方式是miRNA通过与靶基因的3′-UTR 结合抑制靶基因的表达，继而发挥不同的生物学功能。miRNA靶基因众多，在不同发育阶段或组织细胞中起主效作用的靶基因可能存在差异，而单个靶基因又会同时受到多个miRNA调控，共同构成复杂的调控网络[21-22]。Wu等[12]研究发现，miR-145-4可以靶向DDIT3基因调控蛋鸭卵泡发育。本研究使用Targetscan网站共预测到1 680个miR-145-4的靶基因，从中挑选与细胞增殖凋亡相关的基因，确定PIK3CA基因作为候选靶基因，经试验验证结果显示，miR-145-4可以靶向PIK3CA基因。已有研究报道，PIK3CA参与了卵巢癌的发生发展[23],PIK3CA基因的突变与乳腺癌发生发展及预后相关[24]。本研究结果表明，PIK3CA基因中存在miR-145-4的结合位点，利用双荧光素酶法验证了二者之间的结合关系；进一步分析发现，miR-145-4通过靶向PIK3CA基因促进了蛋鸭卵泡颗粒细胞的凋亡，进而参与了蛋鸭卵泡发育的调控过程。本研究首次明确了PIK3CA基因为miR-145-4的靶基因，并初步明确了二者在蛋鸭卵泡颗粒细胞中的作用及可能的调控机制，为深入探究miRNA 在禽类卵巢颗粒细胞中的功能提供理论依据，但miR-145-4在蛋鸭卵泡发育中的功能及其作用机理尚待进一步的试验验证。

4 结 论

本研究发现，miR-145-4促进了蛋鸭卵泡颗粒细胞的凋亡；预测发现其靶基因PIK3CA3′-UTR存在miR-145-4的结合位点，利用双荧光素酶活性检测验证了miR-145-4能够与PIK3CA基因3′-UTR结合并发挥调控作用；过表达或抑制表达miR-145-4后PIK3CA基因的表达量显著升高或降低。综上，推测miR-145-4通过靶向PIK3CA基因促进了蛋鸭卵泡颗粒细胞的凋亡。