稳定表达IL-10的PK-15细胞的构建及其在PCV2增殖中的应用

张敬寒，李枝兰，韩佃刚，何 帅，刘金华，吕念词，邹丰才，柴 俊，张以芳

(1.云南农业大学动物医学院，昆明 650201；2.昆明海关技术中心，昆明 650051；3.中国农业大学动物医学院，北京 100193)

猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2，PCV2)是一种二十面体对称的小型非薄膜DNA病毒[1]。 它具有较强的致病性，可引起猪圆环病毒相关疫病(porcine circovirus associated disease,PCVAD)[2-3]。PCV2基因组通过滚圈复制机制进行复制，造成感染后机体的免疫抑制与持续性感染，这一特征为其防控带来阻碍，且其机理尚不明确[4-5]。目前流行的基因型PCV2d是世界各地生猪生产系统面临的一个挑战，由于PCV2的优势基因型不断发生转变，导致了遗传多样性的产生[6]，为圆环病毒的防治带来了困难，提高了疫苗的研发难度。

白细胞介素-10(IL-10)是调节性T细胞(Treg)发挥负调控作用的细胞因子和抗炎因子[7]，同时介导Th1和Th2免疫反应的负反馈调控[8]。当机体长期处于持续感染阶段，病毒侵入机体会诱导免疫细胞产生高水平的IL-10，降低抗原呈递能力，使T细胞活化效率降低，从而抑制抗病毒效应的免疫应答[9]。 研究发现，被PCV2感染的猪组织中IL-10上调，感染PCV2的外周血单核细胞(PBMC)和树突状细胞(DCs)也能过表达IL-10，但被诱导的IL-10高表达对PCV2感染机体的意义尚不明确[10-11]，用IL-10阻断PCV2感染引起的主要通路，以及IL-10减弱促炎细胞因子和PCV2特异性抗体的产生，发现IL-10在PCV2感染和复制中起到了重要作用[12-13]。

目前，PK-15细胞通常用于PCV2的增殖，但病毒传播极其缓慢，细胞对PCV2感染的敏感性较差，病毒滴度远低于预期，通过添加外源性试剂或细胞因子来提高病毒滴度成本较高且效果不明显，从而限制了疫苗的生产[14-15]。因此，筛选PCV2高感染性细胞系和提高PCV2病毒滴度具有重要意义。Yang等[16]研究报道，通过慢病毒转染构建了稳定表达猪IL-2的PK-15细胞系，显著增强了PCV2的复制能力。据此，推测猪IL-10基因的过表达可以持续增加PCV2的体外增殖。本研究利用慢病毒表达系统构建表达猪IL-10的慢病毒，以慢病毒转染的方式实现细胞内IL-10的过表达，并检测过表达IL-10对PCV2在体外细胞内增殖的影响，以期为后续体内试验的开展提供技术支持，为进一步揭示IL-10与PCV2感染的分子意义提供参考依据，为疫苗的研发和PCV2的防控提供解决思路。

1 材料与方法

1.1 材料

猪肾细胞(PK-15)、人胚胎肾上皮细胞(293T)及云南分离PCV2d毒株KM-2018(GenBank登录号：MK405698)均由云南农业大学微生物实验室分离保存；过表达的慢病毒载体pCDH-CMV-MCS-EF1-GFP+Puro、包装质粒psPAX2和pMD2.G均购自湖南丰晖生物科技有限公司；胎牛血清、LB培养基、DMEM培养液、EasyPure Quick Gel Extraction Kit、2×EasyTaqSuperMix及无内毒素质粒提取试剂盒均购自北京全式金生物科技有限公司；抗PCV2的鼠单克隆抗体(一抗)和FITC标记的羊抗鼠IgG抗体均购自GeneTex公司；大肠杆菌DH5α感受态细胞、pMD19-T载体、限制性内切酶XbaⅠ和BamH Ⅰ、T4 DNA连接酶、嘌呤霉素、DNA病毒基因组提取试剂盒、细胞增殖-毒性检测试剂盒(CCK-8)均购自宝生物工程(大连)有限公司；DNA-Hieff TransTM脂质体核酸转染试剂盒购自上海翊圣生物科技有限公司。

1.2 引物设计及合成

以β-actin为管家基因，根据GenBank中IL-10(登录号：DQ058295、AB000514)和PCV2(登录号：AF408635、FJ667592)基因序列设计引物，分别用于检测IL-10、PCV2标准品的制备及PCV2的绝对定量，引物信息见表1。引物均由昆明擎科生物科技有限公司合成。

表1 引物信息

1.3 慢病毒表达载体的构建及包装

对慢病毒表达质粒pCDH-CMV-MCS-EF1-GFP+Puro和合成的质粒菌液pUC57-IL-10分别用XbaⅠ和BamH Ⅰ进行双酶切。经0.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定，酶切产物胶回收后与目的基因IL-10进行连接转化，菌液进行PCR扩增。PCR扩增体系25 μL：2×EasyTaqSuperMix 12.5 μL，上、下游引物各1 μL，菌液1 μL，ddH2O 9.5 μL。PCR扩增程序：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共32个循环；72 ℃延伸7 min。按照无内毒素质粒提取试剂盒说明书对菌液提取质粒，重组质粒pCDH-CMV-IL-10用限制性内切酶XbaⅠ和BamH Ⅰ进行双酶切，酶切产物用0.5%琼脂糖凝胶电泳检测，酶切鉴定正确的阳性克隆送至昆明擎科生物有限公司测序。将测序正确的质粒进行核酸浓度测定，进行转染。提前一天将293T细胞按照1×105/孔铺于6孔板(不含抗生素)，当细胞密度达到95%时，使用DNA-Hieff TransTM脂质体核酸转染试剂盒将重组质粒pCDH-CMV-IL-10与包装质粒psPAX2和pMD2.G共转染293T细胞，分别于24、48和72 h在普通显微镜下观察细胞形态，在荧光显微镜下观察GFP表达情况；并分别收集共转染48和72 h的慢病毒液上清，合并后用0.45 μm过滤器过滤，用于感染PK-15细胞。

1.4 稳定表达细胞系筛选

慢病毒包装后，将PK-15细胞铺于24孔板中，24 h后按梯度加入(1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5及5.0 μg/mL)嘌呤霉素。37 ℃、5% CO2培养箱中继续培养，经10 d左右杀死全部细胞的最小浓度为筛选稳转细胞的浓度。在最后一次收集病毒液上清的同时复苏PK-15细胞，在PK-15细胞汇合度达到60%左右时，于不同细胞孔中分别加入2 mL pCDH-CMV-IL-10的重组慢病毒液和包装的慢病毒液，对照组为不加病毒液的PK-15细胞。37 ℃、5% CO2培养箱中培养24 h后，换为完全培养基；48 h后观察细胞的荧光表达情况，同时换为含嘌呤霉素的培养基，直到对照组细胞全部死亡；将加入pCDH-CMV-IL-10和pCDH-CMV-GFP的慢病毒液组的细胞重新传代，扩大培养，得到的细胞命名为PK-15-IL-10和PK-15-pCDH。 将PK-15-IL-10、PK-15-pCDH和PK-15细胞分别铺于6孔板，培养24 h后，待细胞汇合度到60%左右接种PCV2，分别于6、12、24及48 h收样，提取细胞总RNA和病毒DNA，病毒DNA进行PCR扩增后用0.5%琼脂糖凝胶电泳检测，再利用实时荧光定量PCR和Western blotting检测PCV2感染后IL-10的表达水平。

1.5 实时荧光定量PCR扩增

经PCR鉴定成功的PCV2阳性质粒按照1∶10进行梯度稀释，建立PCV2实时荧光定量PCR检测的标准曲线。通过标准曲线和Ct值，计算样品PCV2的拷贝数。PCR反应体系20 μL：TB Green Premix ExTaqⅡ(2×) 10.0 μL，上、下游引物各0.8 μL，ROX Reference Dye(50×) 0.4 μL，cDNA 2.0 μL，加双蒸水补足体系。PCR反应程序：95 ℃预变性30 s；95 ℃变性5 s，60 ℃退火延伸30 s，共40个循环。使用SPSS 23.0软件中单因素方差分析法分析不同时间段内IL-10的表达水平和PCV2的复制情况，数据用平均值±标准差表示，P<0.01表示差异极显著，用GraphPad Prism 6作图。

1.6 Western blotting检测

用蛋白裂解液裂解细胞，离心取上清，即蛋白样，用BCA方法测定并计算蛋白浓度。制备15%分离胶与5%浓缩胶，上样电泳后转膜并进行抗体孵育，转印后的膜用膜封闭液封闭30 min。单克隆抗体按1∶200稀释，按一定比例加入封有膜的杂交袋中，4 ℃过夜孵育。将一抗按1∶3 000稀释，清洗5次；二抗按1∶4 000稀释，室温下摇床孵育2 h，清洗5次后用ECL化学发光检测系统检测蛋白条带。

1.7 细胞增殖试验

按CCK-8说明书进行细胞增殖试验，在96孔板中培养PK-15-IL-10、PK-15-pCDH和PK-15 3组细胞，分别于24、48及72 h往不同的孔中加入10 μL CCK-8溶液；不同时间段的每组细胞均设置重复和空白对照，培养3 h后，使用酶标仪测定450 nm处的吸光值；根据不同时间点的吸光值，绘制增殖曲线。

1.8 间接免疫荧光试验(IFA)

将PK-15-IL-10、PK-15-pCDH和PK-15细胞分别铺于96孔细胞培养板中，待细胞密度达到80%时，每孔细胞感染100 μL已稀释的病毒液，每一稀释度做8个重复，阴性对照孔只加培养基，3组细胞均做同样的处理；37 ℃、5% CO2培养48 h，PBS洗涤后用4%多聚甲醛固定细胞15 min，用10%脱脂奶粉封闭2 h，加抗PCV2的鼠单克隆抗体，置4 ℃孵育过夜；洗涤后加入羊抗鼠的IgG抗体，室温避光孵育1 h；再次洗涤后用含DAPI的封片剂封片，在倒置荧光显微镜下观察发红色荧光的细胞孔数并记录，病毒滴度以TCID50/0.1 mL表示，参照Karber方法计算。

2 结 果

2.1 IL-10基因PCR扩增结果

对pUC57-IL-10质粒进行PCR扩增，得到546 bp的清晰条带(图1)，与预期片段长度相符；用限制性内切酶XbaⅠ和BamH Ⅰ进行双酶切鉴定，得到两条分别约为2 700和546 bp的清晰条带(图2)，与预期片段大小一致。

M，DL15000 DNA Marker；1，阴性对照；2，pUC57-IL-10质粒PCR扩增产物M，DL15000 DNA Marker；1，Negative control；2，PCR amplification product of pUC57-IL-10 plasmid图1 pUC57-IL-10质粒PCR扩增结果Fig.1 PCR amplification result of pUC57-IL-10

图2 pUC57-IL-10双酶切鉴定Fig.2 Double enzyme digestion identification of pUC57-IL-10

2.2 重组质粒pCDH-CMV-IL-10的构建

酶切后的pCDH-CMV-MCS-EF1-GFP+Puro表达质粒和猪IL-10基因的胶回收产物用T4 DNA连接酶连接、转化，对菌液进行PCR鉴定，结果显示，在546 bp处有与预期大小相符的条带(图3)；提取质粒双酶切，电泳得到两条(约8 100和546 bp)与预期大小相符的条带(图4)。

2.3 慢病毒包装结果

将重组质粒pCDH-CMV-IL-10与包装质粒psPAX2和pMD2.G共转染293T细胞，分别于24、48和72 h在普通显微镜下观察细胞形态，在荧光显微镜下观察GFP表达情况，结果显示，24 h时已经有荧光出现；48 h时细胞状态最好，荧光最强；72 h时荧光有减弱的趋势(图5)。 pCDH-CMV-IL-10和pCDH-CMV-GFP组间荧光亮度无差异，说明病毒载体在293T细胞中表达。

2.4 慢病毒液感染PK-15细胞结果

分别收集共转染48和72 h的慢病毒液上清，合并后用0.45 μm过滤器过滤，感染PK-15细胞后发现pCDH-CMV-IL-10组(PK-15-IL-10)的荧光最强，pCDH-CMV-GFP组(PK-15-pCDH)和正常的PK-15间荧光亮度无差异(图6)。

2.5 PK-15稳转细胞的筛选及鉴定结果

2.5.1 PK-15稳转细胞的筛选 筛选得到嘌呤霉素浓度为2.5 μg/mL。 pCDH-CMV-IL-10的重组慢病毒液感染PK-15后，有绿色荧光蛋白表达，将培养基换为含2.5 μg/mL嘌呤霉素的完全培养基继续培养，每24 h更换一次，待对照组的细胞全部死亡时，收取试验组的细胞于普通培养基中传代扩大培养，得到稳转的细胞株，仍有绿色荧光表达(图7)。

M，DL1000 DNA Marker；1，菌液PCR扩增产物；2，阴性对照M，DL1000 DNA Marker；1，PCR amplification product of bacterial solution；2，Negative control图3 菌液PCR扩增结果Fig.3 PCR amplification result of bacterial solution

图4 pCDH-CMV-IL-10双酶切鉴定Fig.4 Double enzyme digestion identification of pCDH-CMV-IL-10

图5 慢病毒包装后不同时间293T细胞状态与GFP表达情况(200×)Fig.5 293T cell status and GFP expression at different time after lentivirus packaging (200×)

图6 慢病毒液感染PK-15细胞后GFP表达情况(100×)Fig.6 GFP expression in PK-15 cells infected with lentivirus supernatant (100×)

图7 PK-15稳转细胞GFP表达情况(100×)Fig.7 GFP expression in PK-15 stable cells (100×)

2.5.2 PK-15稳转细胞的鉴定结果 利用pCDH-CMV-IL-10的慢病毒液感染PK-15细胞，经PCR扩增后得到546 bp的目的条带(图8)。采用实时荧光定量PCR检测慢病毒液感染PK-15细胞48 h后PK-15-IL-10、PK-15-pCDH和PK-15细胞系中IL-10基因mRNA的表达水平，结果显示，PK-15-IL-10细胞系中IL-10基因表达水平极显著升高(P<0.01，图9)，约为对照组PK-15-pCDH和PK-15细胞中的600倍。分别收集PK-15-IL-10、PK-15-pCDH和PK-15细胞，提取细胞总蛋白进行Western blotting试验，结果显示，IL-10在pCDH-IL-10细胞株中的表达量明显多于对照组PK-15-pCDH和PK-15中的表达量(图10)。连续传代3次后，使用CCK-8进行细胞增殖试验，发现PK-15-IL-10、PK-15-pCDH和PK-15细胞之间差异不显著(P>0.05，图11)。 说明猪IL-10基因在细胞中过表达对细胞活力无明显影响。

M，DL2000 DNA Marker；P，阳性对照；N，阴性对照；1，PK-15-IL-10；2，PK-15-pCDH；3，PK-15M，DL2000 DNA Marker；P,Positive control;N,Negative control;1，PK-15-IL-10；2，PK-15-pCDH；3，PK-15图8 IL-10基因的PCR扩增Fig.8 PCR amplification of IL-10 gene

与PK-15和PK-15-pCDH相比，**，差异极显著(P<0.01)；无*，差异不显著(P>0.05)。图11、12、16同Compared with PK-15 and PK-15-pCDH，**，Extremely significant difference (P<0.01);No *，No significant difference (P>0.05).The same as fig.11,fig.12 and fig.16图9 IL-10基因mRNA的表达情况Fig.9 Expression of IL-10 gene mRNA

图10 IL-10蛋白的表达情况Fig.10 Expression of IL-10 protein

图11 PK-15-IL-10、PK-15-pCDH和PK-15细胞增殖试验结果Fig.11 Proliferation results of PK-15-IL-10，PK-15-pCDH and PK-15 cells

2.6 IL-10对PCV2复制的影响

2.6.1 实时荧光定量PCR检测感染PCV2后IL-10基因的表达量 由图12可知，在稳转细胞系PK-15-IL-10中，随着时间的增加IL-10基因的表达水平都有显著升高，在12～48 h，稳转细胞系PK-15-IL-10中IL-10基因的表达水平均极显著高于对照组PK-15-pCDH和PK-15细胞系(P<0.01)。

图12 PK-15-IL-10、PK-15-pCDH和PK-15感染PCV2后不同时间IL-10基因的表达水平Fig.12 Expression of IL-10 gene of PK-15-IL-10，PK-15-pCDH and PK-15 at different time after PCV2 infection

2.6.2 实时荧光定量PCR检测PCV2的拷贝数 采用PCV2实时荧光定量引物检测感染PCV2后不同时间内PCV2的复制情况，结果显示，PK-15-IL-10细胞中的PCV2含量极显著高于PK-15细胞(P<0.01，图13)。为了评估PCV2在细胞内增殖是否可以持续增加，将病毒稀释连续传3代，结果显示，PK-15-IL-10细胞中的PCV2极显著高于PK-15细胞(P<0.01，图14)。说明PCV2在过表达IL-10的细胞系中病毒复制量显著增加。

2.6.3 间接免疫荧光检测结果 将接种PCV2 48 h的细胞进行间接免疫荧光检测，结果显示，在PK-15-IL-10、PK-15细胞中均可看到荧光，与PK-15细胞相比，PK-15-IL-10细胞中荧光更强(图15)。

与PK-15相比，**,差异极显著(P<0.01)。图14、17同Compared with PK-15,**,Extremely significant difference (P<0.01).The same as fig.14 and fig.17图13 PCV2拷贝数Fig.13 PCV2 copy number

图14 PCV2基因组的拷贝数Fig.14 Copy number of the PCV2 genome

图15 免疫荧光试验检测PCV2对PK-15细胞的感染结果(100×)Fig.15 Immunofluorescence assay to detect the infection of PCV2 on PK-15 cells (100×)

2.6.4 病毒滴度及生长曲线测定 PCV2感染PK-15-IL-10、PK-15-pCDH和PK-15细胞后，用Karber法计算所得病毒滴度分别为1×107.5、1×104.5和1×104.65TCID50/0.1 mL,且PK-15-IL-10细胞中病毒滴度极显著高于PK-15-pCDH和PK-15细胞(P<0.01，图16)。生长曲线显示，PCV2在PK-15-IL-10细胞中的TCID50在感染后48 h极显著高于PK-15细胞(P<0.01，图17)。

图16 PCV2病毒滴度比较Fig.16 Virus titer comparison of PCV2

图17 PCV2生长曲线图Fig.17 Growth cruve of PCV2

3 讨 论

PCV2是公认的对猪场威胁最广泛的病原体之一，市场上有各种商业疫苗和诊断试剂，但疫苗的开发和生产需要高产量的PCV2[17]。目前，PK-15细胞普遍用于PCV2的增殖，由于PCV2的DNA复制依赖于细胞核中细胞分裂的S期和G2/M期，其合成依赖于细胞S期表达的细胞酶，病毒DNA不能自己穿透核膜，这减慢了PK-15细胞的增殖，而且体外培养得到的PCV2病毒滴度相对较低，从而限制了疫苗的生产[14]。因此，筛选PCV2高感染性细胞系和提高PCV2病毒滴度具有重要意义。Sachdeva等[18]研究发现，在细胞培养中添加氨基葡萄糖、细胞因子(IL-2、IFN-α、IFN-γ)、热休克蛋白90或Tween-20等，可使含有病毒抗原的细胞数量增加50倍,并筛选出稳定的PK-15细胞系。Ma等用[19]猪IL-2基因转染PK-15细胞建立了PCV2在体外的高增殖细胞系；Sachdeva等[18]利用慢病毒载体通过转导将基因转入有丝分裂细胞和非有丝分裂细胞，实现在细胞中高效、安全、持久表达目的基因。因此，本研究中选用了慢病毒过表达载体。

PCV2通过感染猪肺泡巨噬细胞(PAMs)进入猪体内后，能通过不断地在细胞内复制实现持续性感染，在感染后易引发与其他细菌或病毒病的混合性感染，造成这一现象的机制尚不明确[20]。PCV2感染后期IL-10基因的表达量增加，处于亚临床PCV2感染的猪，瞬时的IL-10反应与感染的病毒量相关[21-22]。利用PCV2体外诱导表达IL-10可减少IFN-γ的分泌量，说明使用PCV2诱导IL-10的产生可改变抗原刺激反应[23]。本研究通过构建过表达IL-10慢病毒载体，筛选出过表达IL-10的稳转PK-15细胞系，并研究该细胞系体外复制PCV2的作用，为多种细胞试验及动物试验的简便性与安全性等研究提供了参考。结果表明，IL-10的高表达促进了PCV2在PK-15细胞中的复制，这一发现或许可用于扩增高滴度病毒细胞系的构建，为临床上免疫抑制的防控提供科学依据。IL-10作为PCV2感染后诱导机体分泌增加的免疫抑制细胞因子，是多种病毒逃逸人类免疫系统的靶点[24]，它与病毒持续感染和清除密切相关，推测其可能直接介导PCV2免疫抑制发生，是促进机体发生混合感染的重要原因，IL-10的高表达对病毒增殖的促进作用也可能是导致混合感染的重要原因[25]，这有利于临床防控，但可能存在更复杂的机制，具体仍需进一步研究。综上所述，IL-10的高表达促进了PCV2的复制，在PCV2免疫抑制中具有重要意义，筛选出的稳定表达猪IL-10的PK-15-IL-10细胞更容易感染PCV2，是一类很有潜力的疫苗生产细胞系。

4 结 论

本研究成功构建了pCDH-CMV-IL-10的慢病毒表达载体，并建立稳定过表达IL-10的PK-15细胞系。通过实时荧光定量PCR、Western blotting、IFA等方法鉴定分析发现，过表达IL-10可以促进PCV2在PK-15细胞中的复制。试验筛选得到的PK-15-IL-10细胞系，是一类很有潜力的疫苗生产细胞系。