晒青茶灭菌方法研究

安江珊，王利妍，刘琨毅,2，吕伟，李崇萍，李红叶，赵明

1.云南农业大学 茶学院，云南 昆明 650201；2.宜宾职业技术学院 五粮液技术与食品工程学院，四川 宜宾 644003

0 引言

晒青茶指鲜叶经杀青、揉捻后，采用日晒干燥制备的绿茶，一般用作云南普洱茶的原料[1]，其中，日晒干燥是晒青茶品质形成的关键[2-3]。由于日晒干燥过程环境开放、条件温和，晒青茶易被微生物污染[4]，因此有必要开展晒青茶灭菌方法研究。

目前，食品工业中普遍应用的灭菌技术包括辐照灭菌、紫外灭菌、微波灭菌、高压蒸汽灭菌、巴氏消毒、臭氧灭菌等[5-9]。其中，辐照灭菌是利用γ射线、能量低于5 MeV的X射线或10 MeV以下电子束杀灭微生物的过程，主要应用于医疗器械、食品、日用品、药品等领域[10-11]。紫外灭菌是利用波长为240～280 nm的紫外线，破坏细菌病毒中的DNA(脱氧核糖核酸)或RNA(核糖核酸)的分子结构，造成生长性细胞死亡和(或)再生性细胞死亡，达到杀菌消毒的目的。紫外灭菌具有无污染、高效率、广谱性、低成本、长寿命等特点[12]。微波灭菌是指利用波长为0.1～1.0 m、频率为300 MHz～300 GHz的电磁波进行灭菌处理，广泛应用于肉制品、水产品、果蔬、罐头、奶制品、农作物、布丁、面包等产品[13]。高压蒸汽灭菌指利用高温使蛋白质变性从而达到杀死微生物的目的，具有温度高、穿透力强、灭菌速度快、效果可靠等优点，是微生物实验室首选的消毒灭菌方法[14]，广泛应用于药品微生物实验室培养基、实验器具、阳性废弃物的日常灭菌。巴氏消毒杀死的主要是食品中的病原菌，广泛应用于牛奶、饮料、啤酒等的灭菌，其灭菌温度低，对灭菌物质的品质影响较小且成本较低[15]。因臭氧是一种特殊的消毒剂和强氧化剂，臭氧灭菌目前已被列入标准冷杀菌技术[16-17]，广泛应用于食品、水处理、医疗、化工、餐饮、贮藏等领域[18]。宁井铭等[19]分别采用紫外灭菌、热风灭菌、蒸汽灭菌和微波灭菌4种方法对普洱散茶进行灭菌处理研究，结果表明，厚度为0.5 cm的散茶经紫外灭菌50 s后，汤色、香气、滋味等俱佳，且黑曲霉(Aspergillusniger)、青霉(Penicillumsp.)、根霉(Rhizopussp.)等霉菌仍能生存，这有利于普洱茶在存放过程中的进一步陈化。王盛良等[20]对30份市售商品茶叶的霉菌污染现状进行分析发现，微波辐照对霉菌具有明显的杀灭效果，辐照灭菌8 min，霉菌的平均杀灭率达90%以上，是茶叶加工及防霉保鲜的一种方便有效的手段。目前，虽然部分学者针对茶叶中的微生物已开展了灭菌研究，但关于晒青茶灭菌方法的研究尚未见报道。

基于此，本文参考已有研究并结合实验室条件，拟采用辐照灭菌、紫外灭菌、微波灭菌、高压蒸汽灭菌、巴氏消毒及臭氧灭菌6种食品工业普遍应用的灭菌方法处理晒青茶，然后进行菌落总数计数，检测彻底灭菌样品的化学成分并进行感官审评，以期寻找一种能够杀灭晒青茶中微生物，并对茶叶成分和感官品质影响较小的灭菌方法，为晒青茶中的微生物控制提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

晒青茶，生产于2017年，购买自云南省普洱茶树良种场，采摘品种为云抗10#，加工标准为一芽二三叶。

酒石酸钾钠、FeSO4、Na2HPO3、KH2PO3、SnCl2、水合茚三酮、乙醇、谷氨酸、浓H2SO4等，均为分析纯，天津大茂化学试剂厂产；甲醇、乙腈，均为色谱纯，美国TEDIA试剂公司产；标准品儿茶素(C)、咖啡碱(CA)、表儿茶素(EC)、表没食子儿茶素(EGC)、表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)、没食子儿茶素(GC)、没食子儿茶素没食子酸(GCG)、儿茶素没食子酸酯(CG)、表儿茶素没食子酸酯(ECG)、没食子酸(GA)、1，4，6-O-没食子酰基-β-D-葡萄糖(GG)、茶叶碱、花旗松素、芦丁、鞣花酸、杨梅素、槲皮素、木犀草素、山奈酚，成都曼思特生物科技有限公司产。

1.2 主要仪器与设备

756CRT型紫外可见分光光度计，上海菁华科技仪器有限公司产；101A-2型电热鼓风恒温干燥箱，上海市崇明实验仪器厂产；HH-S28 S型数显恒温水浴锅，金坛市大地自动化仪器厂产；1200型高速液相色谱系统，美国Agilent 公司产；SW-CJ-1FD型超净工作台，苏州安泰空气技术有限公司产；HWS型智能恒温恒湿箱，宁波东南仪器有限公司产；SK3200LH型超声仪，上海科导超声仪仪器有限公司产；ZD-85A型气浴恒温振荡器，金坛科析仪器有限公司产；A13204-N型电子分析天平，奥豪斯仪器有限公司产；Smart-Q30型实验室纯水系统，上海和泰仪器有限公司产；DHG-9140型电热鼓风干燥箱，上海中友仪器设备有限公司产；LRHS-250-II型生化培养箱，上海跃进器械有限公司产；HZ-GZJ型实验型无菌灌装机，上海辉展实验设备有限公司产；LDZX-50KBS型立式压力蒸汽灭菌锅，上海申安医疗器械厂产；G70F23N1P-M3(S0)型微波炉，格兰仕微波炉电器制造有限公司产。

1.3 实验方法

1.3.1 晒青茶灭菌本研究分别采用辐照灭菌、紫外灭菌、微波灭菌、高压蒸汽灭菌、巴氏消毒及臭氧灭菌6种灭菌方法处理晒青茶，具体方法如下。

1)辐照灭菌。将晒青茶装入洁净干燥的器具中，密封，送往云南华源核辐射技术有限公司处理，设置辐照剂量分别为5 kGy、7.5 kGy，灭菌处理后，茶样放入无菌袋中备用，分别标记为IR1、IR2。

2)紫外灭菌。对洁净工作台进行消毒，放入洁净白纸，将晒青茶放置在白纸上进行紫外照射，设置时间分别为1 min、2 min和3 min，灭菌处理后，茶样放入无菌袋中备用，分别标记为UR1、UR2、UR3。

3)微波灭菌。先对微波炉消毒5 min，再将晒青茶放入微波炉中，设置时间梯度分别为1 min、2 min和3 min，灭菌处理后，茶样放入无菌袋中备用，分别标记为MR1、MR2、MR3。

4)高压蒸汽灭菌。将晒青茶进行121 ℃高压蒸汽灭菌分别处理20 min和15 min，115 ℃高压蒸汽灭菌处理20 min，灭菌处理后，茶样放入无菌袋中备用，分别标记为ST1、ST2、ST3。

5)巴氏消毒。将晒青茶放入干燥箱中，设置温度梯度分别为60 ℃、65 ℃和70 ℃，时间为50 min，灭菌处理后，茶样放入无菌袋中备用，分别标记为PA1、PA2、PA3。

6)臭氧消毒。将晒青茶放入臭氧发生器(即无菌灌装机)中分别处理10 min、20 min、30 min后，茶样装入无菌袋中备用，分别标记为OR1、OR2、OR3。

对以上茶样进行微生物检验，以不灭菌的茶样为对照(CK),筛选出检验合格的灭菌方法进行成分测定和感官审评，从而确定最佳灭菌方法。

1.3.2 微生物培养及菌落总数测定根据《食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定》(GB 4789.2—2016)[21]测定茶样菌落总数。

1.3.3 晒青茶生化成分测定及感官审评按照《茶 水分测定》(GB/T 8304—2013)[22]，采用(103±2)℃条件下的恒重法测定茶样水分；按照《茶 水浸出物测定》(GB/T 8305—2013)[23]，采用水浴加热直接测定法测定茶样水浸出物；采用酒石酸亚铁比色法[24]测定茶叶茶多酚含量；按照《茶 游离氨基酸总量测定》(GB/T 8314—2013)[25]，采用茚三酮显色法[26]测定游离氨基酸含量；采用蒽酮比色法测定茶叶可溶性糖含量；按照本实验室建立的方法[27]，采用高效液相色谱法测定茶叶样品C、CA、EC、EGC、EGCG、GC、GCG、CG、ECG、GA、GG等24种茶叶化学成分含量；按照《茶叶感官审评方法》(GB/T 23776—2018)[28]，进行感官审评。

2 结果与分析

2.1 不同灭菌方法对晒青茶微生物的影响

不同灭菌方法处理的晒青茶中菌落总数见表1。由表1可知，与对照样(CK)相比，紫外灭菌、微波灭菌、巴氏消毒、臭氧灭菌均能杀灭部分微生物，而辐照灭菌和高压蒸汽灭菌能完全杀灭微生物。因此，选择辐照灭菌和高压蒸汽灭菌两种灭菌方法进行后续实验。

表1 不同灭菌方法处理的晒青茶中菌落总数Table 1 The total number of colony forming units in sun-dried green tea sterilized by various methods

2.2 不同灭菌方法对晒青茶化学成分的影响

茶样化学成分含量比较如图1所示，不同肩标小写字母表示同一种化学成分检测含量之间具有显著性差异(P<0.05)。由图1可知，与CK相比，辐照灭菌后的可溶性糖含量显著升高(P<0.05)，C、花旗松素、芦丁、木犀草素含量均显著降低(P<0.05)；高压蒸汽灭菌后的氨基酸、可溶性糖、C、EGC、芦丁、槲皮素含量均显著降低(P<0.05)，CA、GCG、GA、茶叶碱、鞣花酸、山奈酚含量均显著升高(P<0.05)；另外，ST1的EC、ECG、GG、可可碱含量均显著降低(P<0.05)，花旗松素、木犀草素均显著升高(P<0.05)；ST2的EC、GC、CG、ECG、GG含量均显著降低(P<0.05)；ST3的水浸出物、可可碱含量均显著降低(P<0.05)，花旗松素显著升高(P<0.05)。聚类分析发现，CK与IR2聚成一个分支，表明二者之间的化学成分最相似，即7.5 kGy辐照灭菌对茶叶化学成分影响最小。

图1 茶样化学成分含量比较Fig.1 Comparison of levels of chemical components in tea samples

2.3 不同灭菌方法对晒青茶感官品质的影响

茶样感官审评照片及结果分别如图2和表2所示。由图2和表2可知，辐照处理茶样的外形、香气和叶底与CK相比，变化较小；而高压蒸汽灭菌茶样的色泽由褐黄转向乌褐、黄片增加，汤色由黄浓转向橙黄，滋味由浓烈变为平和，且ST1、ST2带有酸味，叶底色泽由黄绿转向褐黄。经感官审评发现，7.5 kGy辐照灭菌处理对茶样IR2的感官品质影响最小，这与生化成分测定结果相符。范伟桥等[29]研究发现，当辐照剂量在一定范围内(0～6 kGy)时，茶叶中主要成分含量随辐照剂量的增加而增加，对香气成分含量的影响不大。另外，本研究结果与彭玲等[30]通过适宜剂量辐照处理红碎茶，既确保红碎茶中霉菌数低于103CFU/g，又不影响红碎茶商品品质的结论是一致的。综上所述，晒青茶的最佳灭菌方法为7.5 kGy辐照灭菌。

图2 茶样感官审评照片Fig.2 Photograph for sensory evaluation of tea samples

表2 茶样感官审评结果Table 2 Results of sensory evaluation of tea samples

3 结论

本文分别采用辐照灭菌、紫外灭菌、微波灭菌、高压蒸汽灭菌、巴氏消毒、臭氧灭菌6种灭菌方法处理晒青茶，发现辐照灭菌和高压蒸汽灭菌均能将晒青茶中的微生物彻底杀灭；7.5 kGy辐照灭菌对茶叶生化成分影响最小，其中只有可溶性糖含量显著升高(P<0.05)，C、花旗松素、芦丁、木犀草素含量均显著降低(P<0.05)；感官审评结果也证实，7.5 kGy辐照灭菌对晒青茶感官品质影响最小。本研究结果可为控制晒青茶的微生物污染，降低安全风险，以及提高后续发酵晒青茶原料的一致性提供参考。