不同酶处理浓缩液对贵州烟草薄片品质的影响研究

马科，蒋登科，龚霜，王东飞，高占甫，瞿方，杨雪鹏，欧明毅

1.郑州轻工业大学 食品与生物工程学院，河南 郑州 450001；2.贵州中烟工业有限责任公司 技术中心，贵州 贵阳 550000；3.贵州黄果树金叶科技有限公司 技术中心，贵州 安顺 561000

0 引言

烟草薄片是以卷烟生产中废弃的烟末、碎烟片、烟梗等为主要原料，经过浸提、浓缩、分离、打浆、磨浆、抄造、烘干、加香等工艺过程制成的一种性能优良的均质化烟叶，又称再造烟叶[1-2]。烟草薄片密度低，焦油释放量低，能够提高卷烟的燃烧性和填充能力，并且可以在一定程度上按照人们的意愿或要求来调整卷烟的物理性能和化学成分，在卷烟生产中得到了广泛的应用[3-4]。

烟草薄片产品在直接抽吸时存在香气平淡、木质杂气重、热辣感强等吸味缺陷[5]，因此需要对其进行改善。已有研究表明，烟草薄片经过适当酶处理后，可以降解其中的大分子物质，促进美拉德反应中还原糖、氨基酸等小分子物质的生成，从而增加烟草薄片中致香物质的含量。如云南瑞升烟草技术(集团)有限公司[6]将酸性蛋白酶、复合果胶酶、复合中性纤维素酶和中性脂肪酶配制成改性添加剂，对烟梗提取液进行处理发现，提取液中果胶、蛋白质等大分子物质发生降解、转化，致香成分的含量明显提高。游霞等[7]利用复合酶制剂对烟草废弃物进行处理，通过GC-MS检测出与烟草香味有关的化合物57种，这些物质具有沁鼻的烘烤味和甜香，能改善烟草吸食品质，对卷烟风味起到了较好的修饰作用。戴丽君等[8]将淀粉酶、果胶酶和木聚糖酶配制成复合酶液进行洗梗实验，发现烟梗、梗膏和烟草薄片中水溶性糖含量均有较大变化，可明显提高烟草薄片的内在品质。因此，为提高烟草薄片产品品质，对其进行酶处理可以达到增加致香物质成分含量、降低刺激性和改善余味等目的[9-10]。

贾伟萍等[11]对10种不同地区来源烟草薄片样品的化学组分进行研究，结果表明，各烟草薄片样品中总糖、还原糖、总植物碱、总氮等化学组分含量差异较大；陈祖刚等[12]对国内和国外来源的造纸法烟草薄片进行了详细比较，结果发现，国产造纸法烟草薄片在吸味和主要香味成分含量上较国外同类产品有一定差距；蔡冰等[13]对比分析进口和国产来源烤烟型造纸法烟草薄片的主要致香成分，结果表明，进口再造烟叶中主要致香成分含量高于国产再造烟叶。不同地区来源原料制成的烟草薄片致香成分差异明显，其主要原因是不同来源原料间化学组分差异较大。研究不同酶制剂对特定原料来源烟草薄片的化学成分影响差异，可挖掘用于提升烟草薄片品质的酶制剂，对烟草薄片的生产具有重要应用价值。

虽然酶制剂在烟草薄片中的应用研究已有文献报道，然而这些文献均未探讨不同酶制剂对特定来源原料制成的烟草薄片的作用差异。鉴于此，本文拟用不同类型酶对贵州地区来源原料的烟草薄片浓缩液进行催化转化处理，考查浓缩液中常规化学成分和香味成分变化，并将酶处理后的浓缩液涂布于烟草薄片片基以评价其感官品质的变化，以期增加烟草薄片浓缩液香味成分的含量和种类，改善其木质气重、香气质不足等问题，为利用酶制剂改善烟草薄片品质提供参考。

1 材料与方法

1.1 主要材料与试剂

浓缩液和烟草薄片片基均由贵州中烟责任有限公司提供；中性蛋白酶(100 U/mg)、果胶酶(500 U/mg)、淀粉酶(50 U/mg)，上海源叶生物科技有限公司产；乙醇、考马斯亮蓝G-250、咔唑、碘、碘化钾、茚三酮、葡萄糖，均为分析纯，上海阿拉丁试剂有限公司产。

1.2 主要仪器与设备

EL204型电子天平，北京赛多利斯仪器有限公司产；Agilent 7890-5975气相色谱质谱(GC-MS)联用仪，美国Agilent公司产；YM50-Z紫外-可见分光光计，上海美谱达仪器有限公司产；同时蒸馏萃取管，郑州轻工业大学自制；HWS-12电热恒温水浴锅，上海一恒科学仪器有限公司产。

1.3 实验方法

pH值、温度和酶反应时间是影响酶活力的重要因素之一，但受设备限制，往往很难在工厂中调整生产温度和pH值。因此本文也直接将酶制剂添加到浓缩液中，在常温和不改变浓缩液pH值的条件下进行实验。

1.3.1 浓缩液酶处理实验组：分别用1 g/L的蛋白酶、0.5 g/L的果胶酶、1 g/L的淀粉酶处理浓缩液作为实验组，以浓缩液原液为空白组，样品反应均在室温下进行，加转子搅拌处理2 h。

1.3.2 常规化学成分的测定酶处理反应结束后立即测量各常规化学成分含量，以空白组为基准计算蛋白质、果胶、淀粉、氨基酸、还原糖、总糖含量的变化率。浓缩液中蛋白质含量测定参考考马斯亮蓝法[14]，果胶含量测定参考咔唑比色法[15]，淀粉含量测定参考碘显色法[16]，氨基酸含量测定参考茚三酮显色法[17]，还原糖和总糖含量测定参考3,5-二硝基水杨酸比色法[18]。

1.3.3 香味成分的测定浓缩液经酶处理后,还原糖、氨基酸等物质含量会发生不同程度的改变，这可能会促进浓缩液中美拉德反应的发生，从而形成一些香味成分。因此为进一步考查不同酶处理对浓缩液中香味成分含量的影响，将采用同时蒸馏萃取法对浓缩液中的香气成分进行提取。具体做法为：分别量取50 mL浓缩液、1 mL内标溶液(质量浓度为1.032 mg/mL的乙酸苯乙酯)和300 mL蒸馏水加入1000 mL烧瓶中，混匀；加入126 g氯化钠和适量沸石，连接到同时蒸馏萃取装置的一端，另一端连接盛有50 mL二氯甲烷的烧瓶，60 ℃水浴加热，同时蒸馏萃取2 h；将烧瓶取下，加入适量无水硫酸钠，置于冰箱中干燥过夜；将萃取液过滤后在46 ℃水浴中浓缩至1.0 mL；经0.22 μm滤膜过滤后，使用GC-MS联用仪分析其挥发、半挥发香味成分。

GC分析条件：色谱柱安捷伦 HP-5(30 m×250 μm×0.25 μm)，载气为高纯氦气；进样口温度230 ℃；载气流速1.0 mL/min。进样方式为分流进样，分流比5∶1，进样量1 μL。升温程序为柱初温50 ℃，保持2 min，以4 ℃/min升至280 ℃，保持5 min，再以4 ℃/min 升至 300 ℃。

MS分析条件：电子轰击源(EI)，电子能量70 eV，离子源温度230 ℃，四级杆温度150 ℃，质谱扫描方式为全扫描，溶剂延迟8 min。

数据分析：香味成分通过NIST谱库进行定性分析。采用内标法进行定量分析，并剔除检测结果中匹配度低于75%的物质。

1.3.4 感官品质评价方法实验组烟支样品制备：取适量酶处理后的浓缩液按照39%的涂布率均匀涂抹在烟草薄片片基上，经90 ℃烘箱干燥后得到成品烟草薄片；烟草薄片切丝后放入温度(22±1)℃和相对湿度(60±2)%的恒温恒湿箱内平衡48 h；用手工卷烟机将烟丝卷制成烟支，每个烟支烟丝质量为0.7 g。

空白组烟支样品制备：取空白组浓缩液按一定回涂比均匀涂抹在烟草薄片片基上，经干燥后得到成品烟草薄片。其余步骤同实验组。

将卷好的烟支放入温度(22±1)℃和相对湿度(60±2)% 的恒温恒湿箱内平衡48 h后进行感官评吸。共选取7位评吸人员，评吸项目参照成品烟评吸标准，即《卷烟 第4部分：感官技术要求》(GB 5606.4—2005 )[19]。由于烟支全部由烟草薄片制作，因此对烟支光泽这一指标不作评价。

2 结果与讨论

2.1 酶处理后浓缩液中常规化学成分变化分析

酶处理后浓缩液中常规化学成分质量分数结果如表1所示。由表1可知，经中性蛋白酶处理后,浓缩液中蛋白质降解率较高，降幅达17.09%；经果胶酶和淀粉酶处理后，果胶和淀粉的降解率较低，降幅分别为8.68%和8.95%。经中性蛋白酶处理后，浓缩液中还原糖、总糖和氨基酸质量分数均有较大程度减少，降幅分别为27.30%、16.18%和14.53%，这可能是由于浓缩液经中性蛋白酶处理后产生的氨基酸与浓缩液中原有的糖类物质发生美拉德反应消耗了一定的底物。而浓缩液在经果胶酶和淀粉酶处理后，还原糖和氨基酸质量分数有所减少，但降幅都不是很大，这可能是酶制剂作用效果不显著所导致；总糖质量分数有所增加，可能是自身水解所导致。

表1 酶处理后浓缩液中常规化学成分质量分数Table 1 The content of conventional chemical components in the concentrate after enzyme treatment %

2.2 酶处理后浓缩液中主要香味成分变化分析

酶处理后浓缩液中主要香味成分及其质量浓度结果如表2所示。由表2可知，浓缩液经中性蛋白酶处理后，香味成分种类和质量浓度均有明显程度提高。香味成分种类特别是美拉德反应产物种类增加明显，如5-甲基呋喃醛、4-环戊烯-1,3-二酮、糠醇、2-乙酰基呋喃、2-乙酰基吡咯等。对比空白组浓缩液，经中性蛋白酶处理后，浓缩液香味成分总含量由0.907 mg/mL提升到2.844 mg/mL，增幅达213.56%。部分烟草特征致香成分质量浓度显著增加，如巨豆三烯酮、大马士酮、二氢猕猴桃内酯，分别增加了31.21%、331.52%和110.00%。

表2 酶处理后浓缩液中主要香味成分及其质量浓度Table 2 Main aroma components and mass concentration in concentrated solution after enzyme preparation mg/mL

浓缩液中香味成分质量浓度的增加,可能是浓缩液中的蛋白质在经过酶处理后产生了大量的氨基酸进而促进美拉德反应所致。一方面，部分芳香族氨基酸自身代谢生成苯甲醇、苯乙醇等香味成分；另一方面，部分游离氨基酸与浓缩液中的糖类物质发生美拉德反应，生成了一些如5-甲基呋喃醛、4-环戊烯-1,3-二酮、糠醇等香味成分。同时，浓缩液中的蛋白质在经中性蛋白酶处理后，大分子蛋白被酶解成相对分子质量大小不等的氨基酸和多肽链，降低了浓缩液的黏稠度，提高了氧气在浓缩液中的溶解度；某些具有特殊结构的多肽链可能增加类胡萝卜素与氧气的分子碰撞机率，从而促进类胡萝卜素的氧化降解，导致巨豆三烯酮、大马士酮、二氢猕猴桃内酯等香味成分质量浓度增加。

本文中性蛋白酶处理浓缩液后香味成分的种类和含量均有所增加的结果与杨宗灿等[20]采用生物酶处理烟草制品后的研究结果一致，也进一步说明了不同酶处理浓缩液有利于促进浓缩液中具有香气特征的小分子化合物的生成，增加浓缩液中香味成分质量浓度，进而提高烟草薄片的整体质量；但经果胶酶和淀粉酶处理后，两组浓缩液中香味成分的种类和质量浓度改变并不显著，这与许春平等[21]研究结果不一致，可能是原料中淀粉和果胶质量浓度较少，酶制剂作用效果不明显所致。

2.3 酶处理后卷烟样品感官品质评价结果分析

各处理组烟支样品感官品质评吸结果如表3所示。由表3可知，中性蛋白酶处理组烟支的香气、谐调性、刺激性、余味明显优于其他组。感官品质总体评价为：中性蛋白酶处理组>淀粉酶处理组>空白组>果胶酶处理组。因此，在浓缩液中添加中性蛋白酶后，烟支的整体抽吸品质有较大提升。

表3 卷烟感官品质评吸结果Table 3 Cigarette smoking sensory evaluation results 分

3 结论

本文对贵州地区来源原料制备的烟草薄片浓缩液进行了生物酶处理，运用GC-MS法等研究了酶处理浓缩液的常规化学成分和香味成分变化，发现烟草薄片浓缩液经中性蛋白酶处理后，蛋白质质量浓度大幅降低，还原糖、总糖和氨基酸质量浓度均有较大程度减少，香味成分种类增多、质量浓度增加。将酶处理后的浓缩液涂布于烟草薄片片基上，并对其感官品质进行评价，发现中性蛋白酶处理浓缩液制得的烟支整体抽吸品质明显优于淀粉酶组、果胶酶组和空白组。本文研究结果为中性蛋白酶在贵州原料来源烟草薄片生产中的应用提供了数据支撑，但本文仅在实验室环境下进行了小范围研究，后续将进一步探究大批量烟草薄片浓缩液的酶处理方法，以期为其工业化应用提供参考。