京山地区对节白蜡与“京翠”亲缘关系的cpSSR 分析

金宇晨，柴隆龙，马 倩，熊燕飞，张建坤，陈碧峰

（1.武汉理工大学化学化工与生命科学学院，武汉 430014；2.湖北森宝园艺有限公司，湖北 荆门 431815）

对节白蜡（Fraxinus hupehensis），又名湖北梣、湖北白蜡，是木犀科梣属落叶大乔木，树皮深灰色，老时纵裂；营养枝常呈棘刺状。喜光，稍耐寒，耐干旱、瘠薄，适应性强。产自中国湖北京山等地，北京等地也有栽培。对节白蜡生长缓慢，寿命长，树形优美，盘根错节，是园林、盆景、根雕家族中的极品，被誉为“活化石”和“盆景之王”［1］。

2013 年在对节白蜡天然种群中发现1 株冠形紧凑、树形优美的品种，经中国林业科学研究院林业研究所鉴定为新品种，命名为“京翠”。与对节白蜡相比，“京翠”具有叶色翠绿，叶片大，树冠紧凑，树型优美，无需修剪，自然成型的特点。从2014 年开始，湖北省京山市林业局就开展了“京翠”品种繁育推广试验。经过5 年的试验，形成了较为成熟的“京翠”品种繁育推广技术［2］。

为探索对节白蜡与“京翠”的遗传距离和遗传一致性，采用叶绿体微卫星（Chloroplast microsatellite，cpSSR）分子标记技术对“京翠”和对接白蜡展开研究，并对其他物种的相关cpSSR 数据进行了汇总分析，旨在从分子水平上揭示两者的亲缘关系。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验所用的对节白蜡和“京翠”样本均取于湖北省京山市虎爪山林场。依据随机取样原则，在对节白蜡和“京翠”的居群内随机挑选3 棵胸径30 cm 以上成熟的大树（相距10 m 以上），每棵树上采集20～30 g当年生嫩叶，置于冰盒内冷藏保存。

1.2 试验方法

1.2.1 DNA 提取 采用TIANGEN 公司的DNAsecure 新型植物基因组DNA 提取试剂盒（DNAsecure Plant Kit，DP320-02），取100 mg 样本幼叶组织，经液氮冷冻研磨成粉末后，根据试剂盒说明书提取DNA。

1.2.2 cpSSR 引物合成 cpDNA 相对保守，cpSSR突变率较低，故cpSSR 引物的通用性较高。本研究选取22 对通用cpSSR 引物［3，4］用于节白蜡和“京翠”基因组DNA 的PCR 扩增（表1），22 对引物均由武汉生工生物公司合成。

表1 22 对cpSSR 引物序列

1.2.3 cpSSR-PCR 反应体系和扩增程序 cpSSRPCR 反应体系为0.1 μL Taq 酶、2 μL Taq 酶buffer、1 μL cpSSR primer（上游+下游）、1.5 μL 模版DNA（20 ng/μL）、10.2 μL RNase-Free Water、0.2 μL dNTP，反应总体系为15 μL。由于引物退火温度的差异，为22 对cpSSR 引物优化出2 套PCR 扩增程序（表2）［5］。反应结束后PCR 产物置于4 ℃保存，待凝胶电泳检测。

表2 22 对cpSSR 引物的PCR 扩增程序

1.2.4 数据分析 在电泳图谱中，同一位置的条带被视作1 个位点，根据同一位置上是否有条带进行统计，有带的记为“1”，无带记为“0”。以对节白蜡的条带为标准，记录数据结果。利用软件POPGENE1.31 计算样本数据的遗传一致度及遗传距离。利用NTSYS-pc2.10 软件根据居群间的Nei's 遗传一致度，对样本数据及其他物种的相关cpSSR 的标准数据进行UPGMA 聚类分析。

2 结果与分析

2.1 cpSSR-PCR 扩增产物检测

对节白蜡和“京翠”基因组DNA 经22 对cpSSR引物进行PCR 扩增后，产物进行凝胶电泳检测，结果如图1 所示。对“京翠”与对节白蜡的3 对样本分别进行cpSSR-PCR 扩增试验，凝胶电泳结果均一致。引物扩增结果特异性强，条带清晰且单一，扩增片段主要集中在100～500 bp，与预测产物条带大小的范围一致［6］。

图1 对节白蜡和“京翠”基因组PCR 扩增后产物的凝胶电泳

2.2 遗传一致度和遗传距离

该研究共提取了ccmp1—ccmp10 引物在其他物种中的试验数据，与对节白蜡和“京翠”的试验数据进行汇总分析，对节白蜡、“京翠”及其他物种间的遗传一致度和遗传距离的结果如表3 所示。由表3 可知，对节白蜡、“京翠”及其他物种间的Nei's 遗传距离值范围为0.066 8～0.916 3，遗传一致度范围为0.250 0～0.933 3，说明所选物种之间特异性明显，条带差异大。其中“京翠”与对节白蜡的遗传一致度为0.461 5，遗传距离为0.602 0，说明两者的遗传一致度较高，但两者间的遗传距离较大。此外，对22 对cpSSR 引物扩增后的凝胶电泳图谱结果进行统计分析发现，对节白蜡和“京翠”的遗传一致度为0.454 5，遗传距离为0.788 5，该结果与10 对引物（ccmp1—ccmp10）计算结果一致。

表3 对节白蜡、“京翠”及其他物种间的遗传一致度和遗传距离

2.3 cpSSR 遗传聚类分析

基于ccmp1—ccmp10 引物扩增结果分析得到的遗传一致度，对上述物种进行UPGMA 遗传关系聚类分析，结果如图2 所示。从聚类图可以看出，对节白蜡、“京翠”和其他物种共同聚成5 个大类：第Ⅰ类包括“京翠”和豆科；第Ⅱ类为对节白蜡、茄科、猕猴桃科、蔷薇科和桃金娘科；龙舌兰科、禾本科和十字花科分别归属于第Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ类。

图2 不同物种间的UPGMA 遗传关系聚类结果

3 小结与讨论

“京翠”自2018 年被培育出来，其与对节白蜡之间的亲缘关系鲜有研究。叶绿体微卫星（cpSSR）是1 种新型的标记技术，目前已被广泛应用到植物种群遗传多样性、种群结构分析、种群分类、系统地理分布等方面研究。由于微卫星（SSR）两侧的碱基序列具有很强的保守性［7］，因此1 个引物可以在另外1个物种上进行稳定扩增，称之为“种间扩增”［8］。而cpSSR 不仅有SSR 的优点，还能兼顾到cpDNA 独立进化的特点，可以通过设计特异引物，对物种的叶绿体DNA 进行PCR 扩增，扩增片段的长度多态性可用作分子标记。采用cpSSR 分子标记方法，首次从分子水平上揭示对节白蜡和“京翠”的亲缘关系，为对节白蜡和“京翠”之间的发育进化关系提供科学依据。

本研究中，首先选用了10 对通用cpSSR 引物对对节白蜡和“京翠”样本的总基因组DNA 进行扩增，产物经凝胶电泳检测后，数据统计分析后发现“京翠”与对节白蜡的遗传一致度为0.461 5，遗传距离为0.602 0。这10 对cpSSR 引物的PCR 扩增试验数据建立聚类图谱发现，蔷薇科与桃金娘科聚在同一支上，并且远离龙舌兰科和禾本科，豆科和十字花科之间的距离则相对较远。对节白蜡与“京翠”的亲缘关系并不近，可能是该研究的cpSSR 位点数量不足，不能充分评估对节白蜡与“京翠”之间的亲缘关系。

此外，利用22 对引物重新对对节白蜡和“京翠”的基因组总DNA 样本进行扩增，对凝胶电泳获取实验数据进行遗传一致性和遗传距离分析发现，2 者的遗传距离和遗传一致性未发生较大改变。综合分析，对节白蜡与“京翠”之间确实存在亲缘关系，但2者的亲缘性并不大。考虑到对节白蜡不同居群之间存在较大的遗传多样性［9］，后续的研究还需纳入更多不同的对节白蜡居群样本，以及野生“京翠”植株的样本，进行更精细的种内比对。同时分子标记技术具有扩增条带统计误差较大等缺点，在今后研究中，需采取多种分子标记技术进行综合比较分析，才能更加全面、准确地解析对节白蜡与“京翠”之间的亲缘关系。