潜在性药物靶点PARP16的研究进展*

吴见乐 卢小路 边水根 朱金妹 张 进 江 峰* 李 健*

（1）赣南医学院康复学院，赣州341000；2）赣南医学院药学院，赣州341000；3）赣南医学院第一附属医院，赣州341000；4）大余县人民医院，赣州341500；5）南昌大学基础医学院，南昌330031）

PARP16（也称为diphtheria toxin-like ART15，ARTD15）是单ADP-核糖基转移酶［1］，其功能是通过对底物NAD+催化，然后将单个ADP-核糖转移到靶蛋白的特定氨基酸残基上［2］。PARP16 可以通过对靶蛋白修饰，改变其生物活性，参与机体内许多细胞的调节，从而影响癌症、囊性纤维化、心血管疾病等的发生与发展。近年来针对PARP16的小分子抑制剂不断出现，表明PARP16作为一个潜在性的药物靶点已经成为研究热点。本文主要综述PARP16 目前已解析的结构、相关疾病以及已有的小分子抑制剂，展望PARP16作为潜在药物靶点的未来发展方向。

1 PARP16的催化结构域

PARP16 与聚腺苷二磷酸核糖聚合酶（poly（adenosinediphosphate-ribose） polymerase，PARP）家族的其他成员相比，有两个明显不同的特征：a.PARP16 是位于内质网的膜锚定蛋白；b.它是唯一已知有C端跨膜区和N端胞质催化结构域的家族成员［1，3］。作为已发现的PARP 家族成员中分子质量最小的一员，PARP16 含有322 个氨基酸。其N端区域（氨基酸1～280）位于细胞质，C 端尾部（氨 基 酸300～322） 位 于 内 质 网 腔 跨 膜 区［3］。Karlberg 等［2］解析了PARP16 的晶体结构，结构表明PARP16 的N 端催化结构域是由6 个α 螺旋形成的不规则束状结构，与其他PARP家族成员的催化结构域氨基酸序列同源性不高。在结构上PARP16由3 个部分组成，分别为螺旋结构域（helical domain，HD；氨基酸5～91）、ADP-核糖基转移酶催化结构域（ADP-ribosyltransferase，ART；氨基酸94～279） 以 及 跨 膜 区（transmembrane motif，TM；氨基酸288～308）［2］（图1a）。大多数PARP家族成员的ART 结构域中有一个与烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）的结合位点，叫做组氨酸-酪氨酸-谷氨酸（H-Y-E）基序，而PARP16 的H-Y-E 基序中没有谷氨酸（E），与NAD+的结合位点是组氨酸H152，酪氨酸Y182 和Y254［2，4］。研究发现，PARP家族成员中多ADP-核糖基转移酶的HD有参与到与NAD+的结合过程中，比如PARP1/2/3的HD靠近其ART 结合位点并且在其上方，从而阻止与NAD+的结合［5-7］。Karlberg 等［2］解析的PARP16 晶体结构表明，PARP16的HD不靠近NAD+的结合位点，因此他们提出了两个关于HD 可能参与到NAD+结合的过程：a.PARP16 ART 中α2 和β3 链的氨基酸（Y193、Ⅰ208）与PARP16 HD的α2′链氨基酸之间形成的疏水作用，从而影响其与NAD+的结合；b.PARP16 HD 中的α2′链氨基酸与ART 中的环-螺旋-环基序通过疏水作用堆积在ART的α1链，从而影响二者的结合。

Fig.1 Structure of PARP16图1 PARP16的结构

2 PARP16的功能与其所介导的相关疾病

PARP 家族成员的主要功能是将细胞中NAD+的ADP-核糖转移到靶蛋白的氨基酸残基上，其连接方式主要是通过酯键。一般来说，将转移一个ADP-核糖的PARP 家族成员称为单ADP-核糖基转移酶，转移多个相同的ADP-核糖形成聚腺苷二磷酸核糖（Poly（ADP-ribose）PAR）链称为多ADP-核糖转移基转移酶［8-10］。而PARP16属于单ADP-核糖基转移酶，可将内质网应激信号传给NAD+，与NAD+的结合位点是由其催化结构域中的H152、Y182 和Y254 构成［2］。PARP16 的C 端是发挥上述功能所必要的，它可以将信号转移到胞质催化结构域，然后再传导给下游信号分子［1］。与其他单ADP-核糖基转移酶不同，PARP16 并不是将ADP-核糖转移到靶蛋白的精氨酸或半胱氨酸残基［3］，其靶蛋白的特定氨基酸主要是天冬氨酸（D）、谷氨酸及酪氨酸［8］。PARP16 可以激活由内质网应激下引起的未折叠蛋白反应（unfolded protein response，UPR）的两个压力传感器：蛋白激酶R样内质网激酶（PERK） 和肌醇需求酶1α（ⅠRE1α）［1］。通过对其ADP-核糖基化使葡萄糖调节蛋白78（GPR78/BiP）从内质网腔内分离，从而使PERK 和ⅠRE1α 发生磷酸化［11-12］。同时PARP16还参与对核转运蛋白β1（Kapβ1）、血管内皮生长因子（VEGF）、血管紧张素ⅠⅠ（AngⅠⅠ）的单ADP-核糖基化［13-15］。通过对上述靶蛋白的修饰，PARP16参与了肿瘤、高血压等疾病的发生与发展。

2.1 PARP16与癌症等疾病密切相关

越来越多的证据表明，内质网应激是调节多种癌症的关键因素之一，其中ⅠER1α和PERK分别参与乳腺癌、肝癌和大肠癌等疾病的调节［16-18］。当内质网腔内未折叠或者折叠错误的蛋白质增多时，就会引起内质网应激，当内质网应激时间正常时，机体中的UPR 通过ATF6、PERK 和ⅠRE1α 三个压力传感器来维护内质网腔内的蛋白质稳态［19］。但如果内质网应激过强或者时间过长就导致UPR 无法维护内质网腔内蛋白质稳态，使UPR 通过上述三个压力传感器传导给下游凋亡信号通路，将保护细胞机制转变为细胞凋亡机制，这是调节癌细胞进程的关键因素之一［20］。PARP16 可以通过对UPR 压力传感器PERK 和ⅠRE1α 的单ADP-核糖基化从而调节内质网应激，影响癌症的进程［1，21］。此外，PARP16还参与对Kapβ1的单ADP-核糖基化，有相关研究发现，Kapβ1 与核转运蛋白α（Kapα）以及核定位序列（nuclear localization sequence，NLS）组成复合物将肿瘤抑制因子P53通过核孔复合体运输到细胞核；而Kapβ1 作为P53 核导入的关键因素，当其活性发生改变可能会导致P53的细胞内定位发生错误，从而影响机体肿瘤细胞的进程。因此PARP16 可通过对Kapβ1 活性的调节从而对肿瘤的发生与发展产生影响［14］。

2.2 PARP16与心血管疾病密切相关

研究表明，导致动脉粥样硬化、高血压和缺血性心脏病等心血管疾病的重要因素之一是血管内皮细胞衰老和内质网应激［22-23］。AngⅠⅠ作为导致动脉粥样硬化和高血压的主要激素，可以促进血管内皮细胞衰老和内质网应激［24-25］。Yang等［13］的研究表明，PARP16 作为上游信号分子可以调节AngⅠⅠ活性以及内质网应激，从而影响心血管疾病。他们还发现，Smyd3作为一种赖氨酸甲基转移酶，通过结合到PARP16 基因的启动子区，然后增加PARP16的活性从而增强AngⅠⅠ的活性［13］。除此之外，血管内皮生长因子（VEGF）也是上述心血管疾病的重要影响因素之一，其功能是通过促进血管生成从而调节血管张力以及压力［26］。VEGF 的生物活性在多个水平上受到严格控制，包括涉及翻译后修饰的过程，其中ADP-核糖基化是影响VEGF 生物活性的最重要因素之一［27-28］。由于VEGF是在内质网和高尔基体进行加工和修饰，PARP16 在内质网中对VEGF 先进行单ADP-核糖基化，这是VEGF 进行多ADP-核糖基化的先决条件，之后位于高尔基体的端锚聚合酶（TNKS2多ADP-核糖转移酶）再对VEGF 进行多ADP-核糖基化［29］。因此，VEGF 的ADP-核糖基化由PARP16 和TNKS2 共同介导，PARP16 可能通过调节VEGF 的活性从而影响心血管疾病［15］。

2.3 PARP16介导囊性纤维化疾病

囊性纤维化（cystic fibrosis，CF）是一种致死性的遗传疾病，最常见的原因是由囊性纤维化跨膜调 节 因 子 （cystic fibrosis transmembrane conductance regulator， CFTR） 中 的 基 因 片 段F508del突变引起的［30］。据表明，UPR中压力传感器ⅠRE1α 的活性与CF 存在密切关系［31］，当CFTR发生突变时就会导致氯离子通道发生失常，引起机体内大量未折叠或者折叠错误的蛋白质进入内质网腔内［32-33］。从而导致ⅠRE1α的核糖核酸内切酶活性被激活，并通过XBP1信号通路来维持内质网蛋白质稳态平衡［34］。但是由于ⅠRE1α 活性过强而导致机体内的巨噬细胞糖酵解速率、ATP消耗以及代谢增加造成机体能量消耗过大［35］。因此，机体较长时间处于能量不足就会引起以慢性疲劳、营养不良和呼吸衰竭为特征的囊性纤维化疾病［32］。Carlile等［31］的研究发现，PARP16 可以通过对ⅠRE1α 单ADP-核糖基化增强其活性，参与内质网应激去调节CF 的进程，表明其可能通过参与ⅠRE1α-XBP1信号通路从而介导CF疾病.

3 PARP16的小分子抑制剂及其晶体结构研究

目前发现，PARP 家族成员的多个抑制剂，这些抑制剂大多是关于聚腺苷二磷酸核糖基化转移酶小分子抑制剂。比如已经通过临床试验而获批上市的PARP1和PARP2抑制剂（奥拉帕利、鲁卡帕尼、尼拉帕利、他拉唑帕尼和氟唑帕利［36］），以及靶向PARP16 的抑制剂Latonduine 衍生物和EGCG 等［31，37-38］（图2）。在PDB 蛋白质结构数据库中也有PARP16 的4 个小分子抑制剂，其与PARP16 之间形成的结合口袋和表面静电势分布已被解析（图3）。

3.1 PARP16与小分子抑制剂的共结晶结构

Karlberg等［2］在2012年解析了PARP16与3-氨基苯甲酰胺的晶体结构（PDB：4F0D，图4a），结构表明：PARP16 中G153 与该化合物分别形成2.6 Å 和3.2 Å 的氢键作用力，而其H152、Y193 与该化合物则形成范德华力。结构表明，PARP16 与NAD+结合的H-Y-E 基序的第3 个氨基酸被Y254 取代，其作用是稳定两者的结合中间体，说明PARP16具有ADP-核糖转移酶活性，可被PARP抑制剂烟酰胺类似物抑制。

Karlberg 等在2018 年 解析了PARP16 与2-［4-［（2S，3S，4R，5R）-5-（6-氨基嘌呤-9-基）-3，4-双（氧化氧烷基）氧杂戊-2-基］羰基哌嗪-1-基］-N-（1-氧化亚烷基-2，3-二氢异吲哚-4-基）乙酰的晶体结构（PDB：6HXR，图4b），结构表明：该化合物与PARP16 H152形成2.7 Å的氢键作用力、与Y153分别形成2.9 Å 和3.1 Å 的两对氢键、与S154 侧链形成2.7 Å的氢键、与S161分别形成2.9 Å和3.3 Å的两对氢键作用力、与G166 形成2.8 Å 的氢键作用力、与H168侧链形成3.1 Å的氢键作用力。

Karlberg 等在2018 年还解析了PARP16 与碳烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的晶体结构（PDB：6HXS，图4c），结构表明：该化合物与PARP16 S154 的侧链形成2.8 Å 的氢键、与S161 形成两对分别为2.8 Å和3.3 Å的氢键、与G166形成2.8 Å的氢键作用力、与H170的侧链形成3.1 Å的氢键作用力、与PARP16 N158、Y182 形成水介导的氢键相互作用力。

Fig.2 Small molecule inhibitors of PARP16图2 PARP16的小分子抑制剂

Fig.3 Binding pockets and electrostatic potential surface distribution of PARP16-inhibitors图3 PARP16与抑制剂的结合口袋和表面静电势分布

Fig.4 Structures of PARP16 with small molecule inhibitors图4 小分子抑制剂与PARP16的结构

Wigle 等［39］在2020 年解析了PARP16 与5-｛5-［（哌啶-4-基）氧基］-2H-异吲哚-2-基｝-4-（三氟甲基）哒嗪-3（2H）酮（RBN01086）的晶体结构（PDB：6W65，图4d），结构表明：该化合物与PARP16主要通过G153 进行结合，与G153 形成两对2.7 Å 的直接氢键作用力和一对水介导的氢键。

PARP16 与这些小分子抑制剂的结构解析和研究在分子水平阐述了它们的分子机理和构效关系，为进一步研发出亲和力强、特异性高、副作用小的抑制剂提供了坚实的结构基础。

3.2 Latonduine衍生物

Carlile 等［31］发现，Latonduine 衍生物对引起CF 的基因片段F508del-CFTR 校正具有较好的效果，其主要作用是通过抑制PARP3、PARP16 的活性 从 而 介 导CF［37，40］。他 们 通 过 比 较 发 现，MCG315（图2 Latonduine衍生物1）体外抑制的校正效果最好，其中MCG315对抑制PARP16的活性达到97%。主要原因是PARP16与ADP结合位点烟酰胺口袋由亮氨酸（L）和酪氨酸组成，形成的略大口袋能够让MCG315 更深地嵌入［31］。之后Centko 等［37］比较了不同的Latonduine 衍生物在体外分别对PARP3 以及PARP16 的抑制，发现了对PARP16更强的抑制剂。在检测中，发现Latonduin A 与Latonduine 衍生物2（图2）有相似的IC50值（分别为10.427 μmol/L、60.362 μmol/L），在体外LatonduinA 对PARP16 的活性抑制达到95%，Latonduine 衍生物2 对PARP16 的抑制几乎达到100%。他们还指出，虽然Latonduine 衍生物2 对PARP16 的抑制性较好，但治疗CF 需要同时抑制PARP3 与PARP16 的 活 性，Latonduine 衍 生 物 如MCG315 与鲁玛卡托（VX809）结合可能是治疗CF的一种最佳手段［37］。

3.3 表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）

绿茶中丰富的表儿茶素没食子酸酯（ECG）和表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）（图2）具有广泛的药理学作用，如化学预防、抗癌、抗感染等［41-42］。吴家雪研究团队［38］通过筛选多种抑制PARP16 活性的化合物发现，ECG 的抑制效果较好，在体外能够完全抑制PARP16，表明ECG是其潜在抑制剂。后来，该研究团队使用朗缪尔反应模型拟合结合曲线，根据其结合动力学常数发现，PARP16分别与ECG和EGCG结合时，其解离常数（Kd）分别为3.41 nmol/L和6.16 nmol/L，表明其与ECG 和EGCG 都具有高亲和力。ECG 和EGCG 在体 外 对PARP16 的IC50分 别 为47.18 μmol/L 和14.52 μmol/L。因此，他们认为EGCG 是PARP16更好的潜在抑制剂。研究也表明，EGCG作为一种潜在的抑制剂，通过对PARP16活性抑制介导癌细胞的凋亡。先前的研究发现，由于在人体肠道容易被吸收，口服单纯的EGCG会导致其生物利用度很低［43］。Gan 等［44］发现，EGCG 与一些天然小分子比如姜黄素、人参二醇、紫檀芪、槲皮素结合时会增加其在机体的生物利用度，从而更有效地抑制癌细胞增殖。因此，未来将诱导内质网应激的药物或者一些其他天然小分子与EGCG相结合可能成为治疗肿瘤的一种有效方法［38］。

4 展 望

近年来，研究人员对于PARP16通过参与内质网应激和核质运输而调节癌症、CF 和心血管疾病等进行了许多的研究和深入探索。本课题组对于PARP16 在内质网应激的信号转导通路也进行了初步研究，但对于怎样将应激信号转导给下游信号分子这一具体通路尚未完全了解，比如PARP16通过PERK 和ⅠRE1α 这两个压力传感器介导癌症等疾病的作用机制。目前，PARP16 抑制剂的研发正在逐渐成为药物研发的热点，PAPR16可以与ADP-核糖基化酶的典型抑制剂3-氨基苯甲酰胺结合，这为接下来研究人员了解其烟酰胺亚位点，从而开发下一代关于烟酰胺模拟物抑制剂提供了一个很好的思路。同时，由于PARP16的抑制剂不断地涌现，研究人员发现其抑制剂与一些小分子化合物相结合治疗相关疾病具有较好的效果。比如EGCG与天然小分子相结合对于治疗肿瘤取得较好的疗效，这为PARP16 抑制剂在未来治疗癌症以及心血管疾病提供了一个非常好的方向。另外，PARP16 还可以与其他PARP家族成员一起参与多种疾病调节，比如CF，表明PARP家族成员在机体中协同参与了多种细胞生命进程。