‘阳光玫瑰’葡萄皱叶花叶症状嫁接传染研究

白先进，娄兵海*，韩佳宇，王博，宋雅琴，白扬，曹雄军，成果

（1. 广西壮族自治区农业科学院，广西南宁 530007；2. 广西特色作物研究院，广西桂林 541004；3. 广西大学农学院，广西南宁 530005；4. 广西真诚农业有限公司，广西南宁 530007）

葡萄（Vitis viniferaL.）是世界上重要的水果之一，面积和产量均居全球水果第二位。据OIV统计，2020年全球葡萄栽培面积约730万 hm2，中国葡萄面积78.5万 hm2，全球占比10.7%，位列第三。但葡萄也是果树中感染病毒最多的树种之一，其病毒种类之多、分布之广、危害之大备受世界关注，目前在葡萄上发现的病毒已有80种[1]。由于葡萄苗木扩繁中长期采用扦插、嫁接等营养繁殖方法，使得葡萄病毒类病害在我国广泛流行，造成产量减少、品质降低，甚至存在毁园的风险。

‘阳光玫瑰’是近年引入我国的优新葡萄品种，但在春季新梢旺长期普遍出现皱缩畸形、斑驳、小叶症状（图1），从而导致植株树势衰弱、结实力降低，并且小苗难以成园。本团队前期的研究证明上述现象与病毒侵染有关[2-3]。鉴于‘阳光玫瑰’葡萄的优良品质，近几年已有大面积的种植，且未来还有推广潜力，因此病毒病的传播问题应该得到足够重视。本研究拟通过嫁接试验进一步明确‘阳光玫瑰’上出现的皱叶、花叶症状是否为病毒感染，从而为‘阳光玫瑰’葡萄病毒病防控提供理论依据。

图1 ‘阳光玫瑰’葡萄叶片皱缩、畸形、斑驳症状Figure 1 Leaf crinkle, misshapen and mosaic symptoms on'Shine Muscat' grapevines

1 材料和方法

1.1 植物材料

供试植物：带毒‘阳光玫瑰’葡萄植株采自广西南宁市武鸣区广西真诚农业有限公司种植园及网室保存的单株；脱毒‘阳光玫瑰’葡萄植株栽植于无病母本园网棚。

1.2 试剂及仪器

参照已报道的文献，分别合成葡萄卷叶伴随病毒1（Grapevine leafroll-associated virus-1，GLRaV-1）、葡萄卷叶伴随病毒3（Grapevine leafroll-associated virus-3，GLRaV-3）、葡萄斑点病毒（Grapevine fleck virus，GFkV）、葡萄扇叶病毒（Grapevine fanleaf virus，GFLV）、沙地葡萄茎痘相关病毒（Grapevine rupestris stem pitting-associated virus，GRSPaV）、葡萄病毒A（Grapevine virus A，GVA）、葡萄病毒B（Grapevine virus B，GVB）和葡萄灰比诺病毒（Grapevine Pinot gris virus，GPGV）的特异性检测引物[4-9]。多糖多酚RNA提取试剂盒产自北京华越洋生物科技有限公司；二步法RTPCR试剂盒产自日本TaKaRa公司。S1000型PCR仪产自美国Bio-Rad公司。

1.3 RT-PCR检测

‘阳光玫瑰’葡萄叶片总RNA提取及各葡萄病毒RTPCR检测方法参照娄兵海等[2,10]。

1.4 嫁接传毒

用热处理结合超微（0.3～0.5 mm）茎尖组织培养获得并通过RT-PCR检测无毒的多年生健康无皱叶‘阳光玫瑰’母树繁育的一年生扦插苗，于2019年6月1日嫁接经RT-PCR鉴定携带多种病毒或单一病毒的有症状‘阳光玫瑰’老熟枝段和经茎尖培养不带毒的有症状‘阳光玫瑰’老熟枝段，长1～2 cm，每株嫁接接种2个芽，4株为一个处理，留3株作空白对照。嫁接30 d后检查芽的存活情况，不存活的进行补接，冬季修剪后下年春天萌发时保留被接种植株一个新芽生长，在2020年5月15日和2021年4月20日观察症状表现情况。

2 结果和分析

对田间表现叶片斑驳、皱缩畸形、小叶等症状的17株‘阳光玫瑰’进行葡萄病毒RT-PCR检测。结果表明，70.6%（12/17）的有症‘阳光玫瑰’植株携带GLRaV-1、GLRaV-3、GFkV、GFLV、GRSPaV、GVA、GVB和GPGV中的一种或多种（表1），表明‘阳光玫瑰’葡萄叶片皱叶、花叶、畸形症状与葡萄病毒侵染密切相关。但也有29.4%（5/17）的有症‘阳光玫瑰’植株未检测出上述8种病毒。

所有试验的脱毒‘阳光玫瑰’葡萄植株一年生苗，在嫁接带毒茎段前均生长良好，未观察到叶片斑驳、皱缩畸形、小叶等症状。

两次观察结果显示，被嫁接植株相继表现叶片斑驳、皱缩畸形、小叶症状（图2）。在两次观察中，被嫁接鉴定的17个单株4个重复中至少有一株表现带毒症状的有16个单株，只有1个被鉴定单株没有表现典型症状，该单株在嫁接前也未检测出葡萄病毒。而作为空白对照的植株，仍生长良好，叶片正常，未出现上述症状。

图2 脱毒无症状阳光玫瑰嫁接染毒后的症状表现Figure 2 Symptoms shown on healthy 'Shine Muscat' grapevines grafted with scions infected or uninfected by grapevine viruses

上述结果表明‘阳光玫瑰’葡萄上出现的皱叶、花叶、畸形症状是通过嫁接传播的病原物引起，并非品种特性。结果也表明，‘阳光玫瑰’葡萄对病毒极为敏感，嫁接带单一病毒的茎段即可引起症状表现，如2号、3号单株，但这两个单株嫁接的4个重复中均只有2株表现出轻微的斑驳症状。结合症状观察还发现，嫁接带多种病毒的茎段症状表现更为明显，如YG3-9-PZ，嫁接传毒的4个重复两年都发病，而且症状明显，说明病毒复合侵染可加重‘阳光玫瑰’叶片症状表现。

此外，未检测出葡萄病毒的5个有症单株，嫁接后亦引起健康‘阳光玫瑰’表现轻微的斑驳、皱叶症状。

3 讨论

本研究对‘阳光玫瑰’上出现的叶片皱叶、花叶、畸形症状是否通过嫁接传播进行了研究。结果表明，‘阳光玫瑰’叶片皱叶、花叶、畸形症状可以通过嫁接进行传播，从而确定上述症状是由病原物侵染引起，而非该品种特性。结合RT-PCR检测结果，推测是由于病毒侵染造成，这与娄兵海等[2]报道的结果一致。

嫁接试验中，部分单株的4个重复有部分表现出症状，但也有部分重复未表现出症状（表1），这种现象可能与当年肥水、植株生长状况有关，因为田间多年观察结果也发现有症‘阳光玫瑰’葡萄植株其症状有些年份轻，有些年份重，或者不表现症状。嫁接试验结果也表明，嫁接材料携带的病毒种类越多，嫁接后‘阳光玫瑰’植株表现的症状就越重，这一结果也与娄兵海等[2]推测的病毒复合侵染会加重植株症状表现的结论一致。

表1 ‘阳光玫瑰’葡萄嫁接传毒症状调查结果Table 1 Results of graft innoculation of grapevine viruses on 'Shine Muscat' grapevines

此外，本研究中还发现，未检测出携带以上8种葡萄病毒的‘阳光玫瑰’植株叶片则表现出症状，其症状也可通过嫁接进行传播，推测可能是这些植株携带其他病毒，因为葡萄上已报到的病毒已达80种[1]。范旭东、李晨等[12-13]报道从部分有症‘阳光玫瑰’植株中还检测出蚕豆萎蔫病毒（Grapevine fabavirus，GFabV）、葡萄浆果内坏死病毒（Grapevine berry inner necrosis virus，GINV）、葡萄卷叶伴随病毒2（Grapevine leafrollassociated virus-2，GLRaV-2）、葡萄卷叶伴随病毒4（Grapevine leafroll-associated virus-4，GLRaV-4）和葡萄病毒E（Grapevine virus E，GVE）。这也表明，‘阳光玫瑰’葡萄对病毒感染极其敏感。

检测鉴定果树病毒类病害的方法有很多，一些快速鉴定方法，如电镜技术、血清学方法、核酸杂交、RTPCR检测、环介导等温扩增、基因芯片和高通量测序等，这些方法提高了植物病毒类病害的鉴定效率。但这些快速鉴定方法也会因为污染、取样部位、取样时间、样品带毒少或不带毒而误检、漏检。而传统的指示植物鉴定对检测结果相对稳定和可靠。

鉴于‘阳光玫瑰’葡萄对病毒极其敏感，在鉴定葡萄病毒病时，可用其作为病毒病鉴定指示植物，以提高葡萄病毒病鉴定准确率，保证葡萄的脱毒母树不带病毒。该品种的发展必须使用脱毒无病种苗。