智能数字聚合酶链式反应系统的开发与应用验证

尚君鹏，贺晓伟，方秋雨，牟 颖

(1.浙江大学 控制科学与工程学院，工业控制技术国家重点实验室，浙江 杭州 310058；2.浙江大学 生物医学工程与仪器科学学院，浙江 杭州 310058)

聚合酶链式反应(PCR)是一种用于体外扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，该项技术已经逐渐发展为检测核酸目标片段的主流分子诊断学技术.数字PCR技术[1-3]属于第三代核酸检测技术，可以在无须建立标准曲线的条件下，实现低浓度的目标核酸分子精确的绝对定量，具有很高的灵敏度及特异性[4-6]，使其在疾病的发现及治疗等方面表现出了极大的优越性，对于提升国民卫生水平、改善国民生活质量具有很高的发展前景及研究价值[7-8].

目前市面上所售卖的商业化数字PCR仪存在着造价昂贵、体积庞大、集成度低、使用成本高等缺点.本文开发了一种体积小、易携带、高集成度、结构简单、低成本、高效率、高准确度的智能数字PCR仪，以方便进行现场实时的核酸检测.

1 系统架构概述

为了满足仪器低成本、高集成的需求，实现更高的现场检测性能，基于微流控芯片[9-10]与智能手机实现数字PCR，系统的架构主要分为上位机与下位机(温控热循环系统)两个部分.如图1所示，上位机主要基于Android智能手机来完成开发，承担的作用主要包括人机交互、数据指令通讯、荧光图像采集、数据处理、结果输出等.下位机基于MSP430单片机，实现了一个微型温控热循环系统，对承载待测样本的微流控芯片实现精准温控，以完成复杂的PCR热循环.

图1 智能数字PCR系统架构

2 温控热循环系统设计与实现

2.1 硬件选型

2.1.1 温度传感器

温度的准确测量对实现精准的温度控制具有必要性，因此，选择一款高精度与高响应特性的温度传感器具有重要意义.本文采用基于晶体振荡器的集成测温模块DS18B20，能够直接输出数字信号，具有体积小、硬件开销低、抗干扰能力强、精度高的特点，能够满足系统的温控需求.

2.1.2 蓝牙通讯模块

温控热循环系统作为小型数字PCR的一部分，需要与仪器等其他模块进行实时的信息传递.蓝牙通讯作为一种经典的无线数据通讯方式，其技术成熟、操作简便，在体积小、功耗低的同时，能够保证设备间的稳定连接与数据流畅通讯.本文采用HC-05蓝牙模块进行上位机与下位机之间的通讯，其成本低，集成度高，并且工作温度范围较大，支持多种波特率，采用8位传输，能够很好地满足本文的仪器设计需求.

2.1.3 半导体制冷片

PCR过程对控温的稳定性和精准度有很大需求.同时，为了使每个独立小室中能够同时在相同的温度条件下进行生化反应，反应空间的温度均匀性同样至关重要.因此，作为温控的核心硬件，半导体制冷片的选型尤为关键.

半导体制冷片是一种热泵，它通过帕尔贴(Peltier)效应可以实现迅速加热或制冷的目的.本文选择了马洛(Marlow)公司生产的LCC-12-10-01L型半导体制冷片(图2)作为升降温元件.该半导体制冷片设计于温度循环应用，尺寸为40 mm×40 mm×4 mm，体积小，重量轻，且工作温度可达130 ℃，具有控温快、温度均匀性好等优点，能够很好地满足本设计方案中PCR反应温度循环的需求.

图2 马洛LCC-12-10-01L型半导体制冷片

2.2 温控系统电路设计

温控系统需要完成的功能主要包括温度的测量、通过单片机生成的PWM波升压给帕尔贴元件进行温度的升降控制、与上位机进行蓝牙通讯等，根据所选硬件，在Altium Designer中设计各模块电路原理图如图3所示.温控系统中的核心部分升压温控模块，将单片机输出的两路PWM波通过74AHC244缓冲器后，送入由两个BTS7960芯片组成的H桥中进行升压，转化成两路幅值为12 V的PWM波供给半导体制冷片来控制温度的升降.

图3 温控系统原理图

2.3 温控系统PCB板的绘制与制作

根据上述的温控系统原理图，将各模块汇总并设计成PCB板.该PCB板可通过设计的单片机接口，使用排插与我们选用的单片机(MSP430FR6989)紧密结合在一起，实现系统集成的同时，方便系统调试与改进优化.系统的设计、制作过程以及最终的温控系统硬件效果如图4所示，最终得到的温控系统符合小型化的预期要求.

图4 温控热循环的PCB图(A)、实物PCB板(B)和完成元件焊接后的PCB板对接单片机的效果图(C)

2.4 温控热循环的实现

一次完整的PCR需要经过重复多次升温变性(90～96 ℃)、降温退火(60～65 ℃)、恒温延伸(70～75 ℃)等三个步骤，整个过程需要通过精确及时的温控来控制反应的进行，因此实现优秀的温控热循环控制尤为关键.

2.4.1 主控制器的选型

温控电路中进行控制的核心元件是主控制器.我们选用了TI公司推出的MSP430FR6989微控制器，其主频可高达16 MHz，内部具有灵活的时钟配置系统.在低功耗方面非常出色，而且价格低廉，体积小，接口丰富，便于设计配套外设电路.

2.4.2 温度控制算法设计

完整的PCR过程涉及多个温度阶段，需要使得温度变化阶段尽量迅速，而维持温度阶段更加具有准确性与鲁棒性.比例、积分、微分算法(PID算法)利用比例单元、积分单元和微分单元进行负反馈调控，被广泛运用于工业控制领域，能够使系统更加稳定，其控制规律为：

(1)

其中，比例控件考虑当前的误差，对产生的误差进行实时的负反馈.积分控件考虑历史累计误差，主要用于消除余差，提高系统的无差度.微分控件考虑将来误差，用比例系数和误差的一阶导数表示，对减少控制器短期变化，增加鲁棒性具有很大帮助.

对上式离散化，即可得到数字PID控制算法，用求和代替积分，用一阶后向差分代替微分，可得到第k次温度采样时的负反馈值.

(2)

本文选择了MSP430系列的MSP43FR6989作为主控制器.仪器上电初始化后，就与上位机建立蓝牙通讯，并等待参数设定和开始命令，并进入低功耗模式.当接收到新PCR扩增命令后，上位机通过蓝牙将参数传入到下位机主控制器，引发串口中断，并开始PCR热循环，直至达到设定循环数.

3 上位机设计与实现

在本系统中，上位机应承担的作用有：人机交互、数据指令通讯、荧光图像采集、数据处理、结果输出等.本系统选择智能手机作为上位机，并在Android平台设计开发了软件，集成以上功能实现更为便捷友好的人机交互.

3.1 数据指令通讯

本文选择蓝牙通讯作为智能手机与单片机热循环系统的通讯方式.这部分应实现以下几个功能：查看周围蓝牙设备列表，连接设备，发送指令、接收数据以及连接失败等情况的处理等.

3.2 荧光图像采集

下位机完成PCR的温度热循环后，调用手机相机对数字PCR荧光图片进行成像，并将其存储在手机中，用于后续的分析处理.

本系统选用了HUAWEI Mate 40智能手机的后置摄像头进行荧光图像的采集.实验室之前的研究也采用Samsung Galaxy 7 Edge、HUAWEI Mate 8、HUAWEI Honor V10等型号的智能手机进行了相关测试[11]，均取得了很好的成像效果，证明本系统已经能适配目前市面在售的大部分智能手机.

3.3 荧光图像处理

在微流控芯片上进行PCR，所得的荧光图像如图5所示.其中的亮点即为阳性小室.荧光定量PCR检测的结果与诸多因素相关，目前对PCR的荧光图像进行处理的方法有基于机器学习的检测方法[11-12]与经典的基于机器视觉的阈值分割方案[13-17].两种方法各有所长，均已被证明能够达到很好的检测效果.

图5 微流控芯片上完成PCR过程所得的荧光图像

其中，基于机器学习的荧光图像检测方法在处理荧光亮度均匀性差和噪声杂点多的荧光图像方面具有更加优秀的表现.但与此同时，这种方案的模型可解释性差，检测精度十分依赖模型的训练效果，也存在着误判与过拟合等风险.基于机器视觉的方法在荧光图像处理领域十分经典，已经受到了广泛的认可，它通过对图像的校正、滤波、反应腔室定位、阈值分割与亮点计数等过程，也很好地起到了突出图像有效细节，排除干扰，提高检测准确性的效果.

本文采用了基于机器视觉的自适应阈值分割方法，基于OpenCV处理所拍摄的图片，进行图像裁剪与校正、通道分离、去除杂点、阈值分割、轮廓检测等操作，最终计算出阳性小室的数量，完成了数字PCR的精确定量.

如图6所示，首先将图像裁剪为图6(A)所示包含4 096个腔室的区域，然后将绿色通道从红色通道和蓝色通道中分离出来.之后，使用top-hat filter对背景进行近似并相减，去除背景后如图6(B)所示.然后使用自适应阈值化方案定义阈值，将图像转换为二值图像，如图6(C)所示，用白色表示阳性小室.最后，采用形态学方法将杂点进行移除[图6(D)],并用轮廓检测工具对图像进行分析，就可以计算出阳性小室的数量，进而得到样本中靶标分子的浓度.

图6 荧光图像处理过程

通过上述过程可以得到阳性小室数量，由于单个小室中可能存在多个阳性DNA分子，因此需要通过统计学方法，使用泊松分布对结果进行校正：

(3)

其中，n代表每个小室的DNA拷贝数；λ代表DNA总数与反应小室之间的比率.每个小室至少有一个DNA分子的概率可表示为：

f0=P(n>0,λ)=1-P(n=0,λ)=1-e-λ

(4)

因此可计算真实的阳性DNA分子数：

(5)

阳性DNA分子浓度即为：

(6)

其中，countreal表示泊松分布校正后的DNA总数；counttotal表示小室总数(4 096)；countgoal表示图像检测得到的阳性小室数.

3.4 上位机软件设计

为了实现更为方便的人机交互与数据通讯，使系统更加智能化、集成化，本系统在Android平台设计了软件，软件的操作流程如下：首先选择一个新测试.选择核酸扩增反应类型(如变温扩增、等温扩增等)，蓝牙连接手机和下位机设备，发出指令，启动温控热循环反应，控制微流控芯片内的样本进行核酸扩增.反应结束后，对数字PCR芯片进行荧光成像.对得到的荧光图片进行阈值分割处理与结果检测.输入反应样本体积，即可得出PCR的定量结果.

4 结论

针对目前市场上的商业数字PCR仪造价昂贵、体积冗余等缺点，基于智能手机与微流控芯片，作者设计开发了一种低成本、高集成的智能数字PCR系统.本文从基本的硬件选型出发，呈现了完整数字PCR仪的搭建过程，并设计搭建温控系统，采用PID控制算法实现了可靠的PCR温控热循环.最后，使用传统机器视觉的方法，对微流控芯片上PCR过程得到的荧光图像进行了处理，成功得到了精确定量的核酸检测结果.