高效液相色谱法快速测定参芪降糖胶囊中人参皂苷的含量

林灵超，黄 燕

(浙江福立分析仪器股份有限公司，浙江 台州 317500)

近年来，我国糖尿病患病率显著增加，根据2015至2017年中华医学会内分泌学会对于糖尿病的流行病学调查显示，我国18岁及以上人群糖尿病患病率为11.2%[1].作为糖尿病防治指南[2]的推荐用药，参芪降糖胶囊可联合其他常用降糖药物改善和治疗因气阴两虚导致的相关症状[3-4]，具有较为重要的临床使用价值.

目前在参芪降糖胶囊的质量研究中，主要采用高效液相色谱法[5-6]和超高效液相色谱法[7-9]测定人参皂苷的含量.受到常规高效液相色谱系统的性能限制，高效液相色谱法常常采用5 μm全多孔填料，在检测参芪降糖胶囊中人参皂苷的含量时，普遍存在分析时间过长(含平衡时间至少在120 min以上)、消耗有机溶剂过多、无法满足复杂样品对分离和分析等缺点.超高效液相色谱法则充分发挥了小粒径全多孔填料(sub-2 μm)的性能，具有较高的分析通量，但需要超高效色谱系统的硬件性能与之匹配才行[10-11]，包括高压溶剂输送单元、低死体积的色谱系统、快速的检测器和自动进样器以及高速的数据采集和控制系统，所以超高效色谱系统的硬件成本、维修成本非常高.同时系统常常面临堵塞、故障率高的风险，客户操作体验感急剧下降.在方法转移时也会引入其他诸多问题[12-13].所以超高效色谱法的推广受到了极大地限制，始终无法有效普及到中药材以及中药制剂企业中去.

近年来，核壳型分离填料在快速分析行业中的应用逐渐引起关注.与5 μm全多孔填料相比，核壳型分离填料可显著缩短分析时间、改善分离效果、提高灵敏度和分辨率.与小粒径全多孔填料(sub-2 μm)相比，核壳型分离填料具有上样量大、色谱柱通透性好、背压低等优势[14-17].但相关的研究均是以2.6 μm核壳型分离填料为主，此时也只有超高效液相色谱系统才能满足对其柱外谱带展宽的要求[18].另外也偶见2 μm以下的核壳型分离填料的分析报道[19]，但至今未出现商品化的超高效液相色谱系统与之兼容.

3.5 μm核壳型分离填料是由2.3 μm直径的超纯实心硅胶核以及外层的厚度为0.6 μm的多孔层组成，同样可缩短待分析物质在填料颗粒内的扩散路径，加快其传质速度，从而实现高柱效和快速分析[20].因此本研究基于3.5 μm Coreshell C18核壳型分离填料(3.0 mm×150 mm)进行参芪降糖胶囊中人参皂苷含量的测定，在现有常规高效液相色谱系统的基础上，即可实现人参皂苷的高柱效、高通量等分析，可以为参芪降糖胶囊的质量控制提供更易被接受和普及的方法.

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

LC5190型高效液相色谱系统(浙江福立分析仪器股份有限公司)；SQP型电子天平(赛多利斯(上海)贸易有限公司产品)；Coreshell C18型色谱分析柱(3.5 μm，3.0 mm×150 mm，ChromaNik Technologies).

人参皂苷Rg1标准物质(纯度为94.0%，批号为110703-202034)，人参皂苷Re标准物质(纯度为96.0%，批号为110754-202129)，人参皂苷Rd标准物质(纯度为97.3%，批号为111818-202104)，均购自于中国食品药品检定研究所；参芪降糖胶囊(每粒装0.35 g，批号为1907051，河南羚锐制药股份有限公司)；纯乙腈，色谱纯；水，Millipore超纯水.

1.2 试验方法

1.2.1 混合标准溶液制备

精密称取人参皂苷Rg1标准物质、人参皂苷Re标准物质以及人参皂苷Rd标准物质适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL含人参皂苷Rg10.2 mg、人参皂苷Re 0.4 mg、人参皂苷Rd 0.2 mg的混合溶液，即得.

1.2.2 供试品溶液制备

取研细后的参芪降糖胶囊囊芯物约0.2 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入水饱和的正丁醇50 mL，密塞，称定重量，摇匀，超声处理1 h，取出，放冷，再称定重量，使用水饱和正丁醇补足减少的重量，摇匀，离心，精密吸取上清液25 mL，回收溶剂至干，残渣加甲醇溶解并转移至5 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，过滤，取过滤溶液，即得.

1.2.3 高效液相色谱条件

Coreshell C18色谱柱(3.5 μm，3.0 mm×150 mm)；流动相A为纯乙腈，流动相B为纯水，进行梯度淋洗(0～20 min，83% B，20～22.5 min，83%～76% B，22.5～35 min，76%～60% B)；流量0.43 mL/min；柱箱温度25 ℃；检测波长203 nm；进样量1.0 μL.

CA125血清检测可用来指导治疗，如果囊肿是良性（非癌症）的且超声波与血清CA125检验结果都正常，就可采用腹腔镜作进一步检验。在癌症治疗中血清CA125值升高意味着肿瘤已发生3～4个月，可作为肿瘤复发指标，一旦升高可指导改变化疗方案[5]。我国多使用B超协助诊断，可在肌层中见到种植内膜所引起的不规则回声增强。CA125测定对子宫腺肌症有诊断价值，但其特异性有待提高。故目前仍需通过询问病史，结合临床症状、体征，辅助B超检查进行诊断[6]。

2 结果与讨论

2.1 方法学考察

2.1.1 专属性试验

精密移取混合标准溶液、供试品溶液适量，在“1.2.3”项下色谱条件进样1.0 μL，结果如图1所示.在供试品溶液色谱图中，3种人参皂苷Rg1的保留时间分别为26.55、26.76、35.53 min.人参皂苷Re和人参皂苷Rd的分离度分别为1.9、1.7，所以两者的分离度符合基线分离要求.3种人参皂苷的拖尾因子均在0.95～1.15之间，峰形对称.经光谱扫描得到3种人参皂苷的峰纯度均较高.因此方法专属性良好.

图1 混合标准溶液、供试品溶液色谱图

2.1.2 精密度

按“1.2.2”项下分别制备供试品溶液4组，按“1.2.3”项下色谱条件各进样测定6次，测得人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rd的峰面积的相对标准偏差分别为2.21%、3.05%、2.93%.表明仪器精密度良好.

2.1.3 重复性

按“1.2.2”项下平行制备供试品溶液6份，依次按“1.2.3”项下色谱条件进样，测得人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rd的峰面积的相对标准偏差分别为0.64%、0.78%、0.91%.表明方法重复性良好.

2.1.4 线性关系

取人参皂苷Rg1、人参皂苷Rd标准物质适量，以甲醇分别配制成质量浓度为5、20、50、100、200、400 μg/mL的溶液.取人参皂苷Re标准物质适量，以甲醇配制成质量浓度分别为20、50、100、200、400、800 μg/mL的溶液.以混合标准溶液的质量浓度为横坐标(X)，不同浓度下的峰面积为纵坐标(Y)进行线性回归计算，得到3种人参皂苷的线性关系，如表1所列.表1结果表明3种人参皂苷在一定的浓度范围内线性关系良好，相关系数均大于0.999 6.

表1 3种人参皂苷的线性关系

2.1.5 稳定性考察

取同一份供试品溶液，分别在配制0、2、6、12、24、48 h后按“1.2.3”项下色谱条件进样，测得人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rd的峰面积的相对标准偏差分别为1.34%、1.51%、1.79%.表明方法稳定性良好.

2.1.6 加标回收率考察

取同一批次参芪降糖胶囊若干份，每份加入低、中、高3个浓度的对照品溶液，按“1.2.2”项制备供试品溶液，按“1.2.3”项下色谱条件进样测定，结果如表2所列.由表2可见，在不同的加标水平下，3种人参皂苷的回收率为95.89%～100.67%，相对标准偏差为1.04%～3.39%.表明方法具有较高的准确度.

表2 3种人参皂苷的加标回收率试验数据

2.1.7 样品含量测定

取平行配制的6份参芪降糖胶囊供试品溶液，按“1.2.3”项下色谱条件进样测定，根据峰面积外标法计算3种人参皂苷的含量.结果显示人参皂苷Rg1平均含量为1.14 mg/粒，相对标准偏差为0.93%.人参皂苷Re平均含量为3.45 mg/粒，相对标准偏差为0.94%.人参皂苷Rd平均含量为1.69 mg/粒，相对标准偏差为0.88%.

2.2 讨论

本试验中，检测波长、流动相组成以及梯度洗脱程序均沿用中国药典[7]中参芪降糖胶囊的条件，其余的色谱条件由试验确定得到.

2.2.1 进样体积的确定

随着色谱柱尺寸的减少，进样体积也需随之降低，以避免柱外效应的增加和色谱柱过载，对色谱分离效果产生影响[21].因此基于所采用3.0 mm为色谱柱的尺寸规格，考察了0.5、1.0、5.0、10.0 μL等不同进样体积的色谱效果.试验发现随着进样体积的增加，3种人参皂苷的理论塔板数、拖尾因子均出现先保持不变，再小幅度的降低的现象,而仪器精密度相对标准偏差却有所提高.因此综合系统适应性参数、仪器精密度、样品的节省量考虑，确定色谱方法中进样体积为1.0 μL.

2.2.2 流量的确定

图2 供试品溶液在不同流速下的色谱图

3 结论

虽已有超高效液相色谱法测定参芪降糖制剂的应用报道，但大多基于sub-2 μm色谱填料与质谱检测器联用为主.一方面仪器设备昂贵，常规中医药企业无法承担.另一方面sub-2 μm色谱填料所导致的非常高的系统压力会引起很多副作用，比如高压会相对容易造成系统和色谱柱性能的下降.高压时，流动相与色谱填料之间产生的摩擦热会造成色谱柱内部温控失衡、色谱峰形的变化、检测器噪声的增加、关键目标峰分离度的变化等，对参芪降糖胶囊的分离分析数据可能会造成显而易见的影响.

因此本研究采用3.5 μm Coreshell C18色谱填料，在常规高效液相色谱系统上，建立了高效液相色谱方法进行参芪降糖胶囊中人参皂苷含量的快速分析，既发挥了超高效液相色谱高效、高通量的特点，又避免出现超高效液相色谱价格昂贵、系统易堵、体验感差、方法转移难等问题.同时该方法的准确性、精密度高，操作也简单，极易被广大中医药企业所认可和接受，可为今后进一步提高参芪降糖胶囊的分析标准提供参考依据.