5个肝豆状核变性家系的临床特征及基因突变分析

程齐齐 杨丽霞 王亮 孙俊 梁佳圆 葛善飞

肝豆状核变性(hepatolenticular degeneration ，HLD)，又名Wilson’s 病(WD)，是一种常染色体隐性遗传病，其发病率为1/30 000～1/100 000[1]。ATP7B基因内的致病性突变是WD发病的主要原因，该突变在铜代谢中起着关键作用，可以直接导致铜的排泄障碍，过量的铜蓄积在肝、大脑及角膜等器官沉积，从而导致相应的病理表现[2]。目前发现的ATP7B基因突变类型已超过800种，不同突变可能对ATP7B功能有着不同的影响，且突变的种类和频率与种族、地区分布有着显著关系[4]，但突变与疾病的临床表现、疾病发作时间以及严重程度之间的相关性尚未明确[3-4]。本研究通过收集5个WD家系的ATP7B基因进行测序，分析其突变特征及其临床特征，并进一步探讨ATP7B基因突变与WD发病的关系，为肝豆状核变性的及时诊断、早期干预治疗及家系遗传诊断提供依据。

资料与方法

一、研究对象

收集5例经江西省南昌大学第一附属医院确诊的WD患者以及患者父母和同胞。患者均为汉族，否认近亲结婚家族史。

二、诊断和排除标准

根据第八届WD疾病国际会议上提出的诊断评分标准[5]：①角膜K-F环，锥体外系症状，血清铜蓝蛋白(ceruloplasmin, CP) <0.1 g/L，24 h尿铜>100 μg或尿铜正常者青霉胺激发试验尿铜> 5倍诊断标准；以上4项指标阳性分别计算2分。②Coombs阴性溶血性贫血，24 h尿铜40～ 100 μg，肝脏组织铜染色阳性，血清铜蓝蛋白0.1～0.2 g/L；以上4项指标阳性分别计1分，ATP7B基因外显子测序检出纯合突变或复合杂合突变计4分，单一位点杂合突变计1分。总分>4分即可诊断为肝豆状核变性。排除自身免疫性肝炎、病毒性肝炎等引起的肝功能异常者，排除外伤及其他原因的引起的神经精神异常者。

三、研究方法

(一) DNA提取 采集患者及其父母、同胞的静脉抗凝血5 mL，用芮宝生物的全血基因组DNA提取试剂盒抽提患者及其父母和同胞基因组DNA，DNA 浓度大于20 ng/μL。。

(二)PCR扩增 对WD患者的ATP7B基因所有外显子进行PCR，引物序列同Ferenci[6]一致，由美国Life Technologies (美国Invitrogen 公司)合成。由ABI 9700 PCR 扩增仪进行PCR扩增。PCR扩增体系为25 μL，包括基因组DNA 2 μL，10×PCR缓冲液2.5 μL，dNTP 2 μL，上下游引物各1 μL，以及1U Taq DNA聚合酶。PCR反应条件如下：95℃预变性5 min；95℃变性30 s、65～57℃退火30 s、72℃延伸30 s，共35个循环；72℃延伸5 min，冷却至4℃。

(三) DNA测序 PCR产物纯化回收后在ABI 3500XL基因分析仪上对产物进行双向测序。测序结果与Ensembl基因数据库中ATP7B(ENSTO0000242839 )基因标准序列比对。

(四) 临床资料 收集先证者发病年龄、临床症状、角膜K-F环、丙氨酸氨基转移酶( ALT) 、天冬氨酸氨基转移酶( AST) 、总胆红素( TBil) 、间接胆红素(DBil)、总蛋白(TP)、白蛋白( Alb) 、凝血酶原时间( PT) 、凝血酶原活动度(PTA)、国际标准化比值(INR)、白细胞计数( WBC) 、血红蛋白( Hb) 、血小板计数( PLT) 、血肌酐(Cr)、血清铜蓝蛋白( CER) 、24 h 尿铜、血铜等资料。所有患者随访至2021年1月，观察患者生存情况。

结 果

一、临床特征、治疗及转归

5个家系中，先证者均为女性，发病年龄6～14岁，除D家系外，其他4个家系先证者均存角膜K-F环及血清铜蓝蛋白降低。A、B家系先证者表现为乏力、纳差，入院后查胆红素高，CT提示肝硬化，诊断为WD(肝型)、肝衰竭，予以青霉胺驱铜、人工肝等治疗后好转出院。其中A家系同胞体检后发现转氨酶升高确诊为WD，予以青霉胺治疗，随访中未出现病情进展。C、D家系先证者均以转氨酶升高入院，均诊断为WD(肝型)，予以青霉胺治疗后出院。但C家系先证者出院后半年内病情迅速进展，出现肝衰竭，经人工肝治疗后病情仍进展，家属决定放弃治疗自动出院。E家系先证者以血小板减少入院，入院后查CT提示肝硬化，MRI表现为豆状核及尾状核对称性异常信号，诊断为WD(肝型)，予以青霉胺治疗后出院，随访中未出现神经系统症状。见表1。

表1 5例WD患者临床表现及实验室检查

二、ATP7B基因检测结果

通过对5个WD先证者及其家系成员进行基因检测，发现7种致病性基因突变，包括5种错义突变(c.2333G>T ，p. R778L；c.2975C>T ，p. P992L；c.2755C>G ，p. R919G；c.1846C>T ，p. R616W；c.3207C>A ，p.H1069Q)，1种无义突变(c.1531C>T，p.Q511X)和1种插入突变(c.3087_3088insT ，p. G1030Wfs*39)，其中插入突变(c.3087_3088insT ，p. G1030Wfs*39)未见数据库和文献报道，为新发现的突变(图1)。此外还检测到10种单核苷酸多态位点： c.1216T>G、c.1366G>C、c.2310C>G 、c.2495A>G 、c.2855G>A 、c.3419T>C 、c.3889G>A 、c.-119_-118insCGCCG、c.-75C>A、c.3903+6C>T。见表2。

图1 7种致病性ATP7B基因突变测序图(箭头示突变位置)

表2 5个WD家系的ATP7B基因突变类型

(续表)

三、家系遗传学特征

5个先证者的ATP7B基因突变均为复合杂合突变，其父母均为单一致病突变基因(杂合)携带者(图2)。A家系同胞体检发现肝功能异常，无临床症状，通过基因检测发现其ATP7B中存在R778L、P992L两种突变，分别遗传自父亲和母亲，诊断为症状前WD，予以青霉胺治疗，病情未出现进展；D家系同胞ATP7B基因检测未发现致病性突变；E家系同胞ATP7B中存在Q511X(杂合)一种突变，遗传自父亲，无临床症状，不足以诊断为WD。

图2 5个WD家系的遗传系谱图

讨 论

WD是一种常染色体单基因遗传的铜代谢障碍性疾病，也是可治疗的单基因疾病[7]。WD患者多以肝脏受累或神经精神系统症状起病，该病常累及多个器官系统，临床表现多样，疾病严重程度不一[8]。临床上WD 疗效与开始治疗的时间密切相关，所以早期诊断与及时针对性治疗对WD 患者尤为重要[9]。随着分子生物学的发展，ATP7B基因突变检测，有助于WD早期诊断，及时治疗，改善患者预后。

目前，已报道的ATP7B基因突变超过800种，以错义或无义突变最为常见，其次是小片段的插入、缺失和剪切位点突变[10]。本研究共检测出7种致病性突变，其中Q511X为无义突变，G1030Wfs*39为插入突变，R778L、P992L、R919G、R616W、H1069Q均为错义突变，其中以R778L突变频率最高。而插入突变G1030Wfs*39未见数据库和文献报道，为新发突变。该变异的携带者临床确诊WD，全外显子检测未发现除R919G和G1030Wfs*39以外的病理性突变位点，且在其下游有类似变异c.3147delC(p.T1050Hfs*71)为数据库和文献报道的致病性突变[11-12]。此外，通过生物信息学软件预测(Mutation Taster)c.3087_3088ins插入突变导致蛋白质翻译提前终止于突变后的第39位氨基酸，可能为致病突变，根据ACMG和AMP联合共识建议[13]判断其为致病性突变。此外还检测出10种ATP7B基因多态位点，多态性位点对遗传病基因易感性、人群迁徙等研究具有一定的价值，且应用单核苷酸多态性单倍型连锁分析可获得更为准确的结果[2]。然而有文献报道，c.1216T>G、c.1366G>C、c.2495A>G、c.2855G>A等单核苷酸多态性的铜离子转运率较低，虽然未从根本上影响ATP7B的功能，但由于个体和环境差异的存在，临床上极少部分单核苷酸多态性携带者仍会出现明显的症状[14]。

WD临床表现有很强的异质性，其基因型与表型的关系也一直是研究的热点，有文献报道，R778L、P992L突变往往预示者较早的发病年龄及更严重的肝脏损害[15-16]。本研究中的A、B家系先证者均为R778L、P992L复合突变致病，发病年龄早，在就诊时均已发展为肝衰竭，与文献报道基本一致。C家系先证者虽以转氨酶升高为首发表现，但在后续的随访中，该患者病情进展快，半年内出现肝衰竭，其ATP7B基因突变中存在插入突变，而插入突变可导致读码框移，使基因表达提前终止，产物截断，功能丧失，致使患者早期发病，肝脏病变严重[17]。D家系先证者虽发病早，但诊断、治疗及时，未出现明显临床症状。E家系先证者虽未出现明显神经精神系统症状，但其颅脑磁共振已发现了异常，而H1069Q突变与中枢神经系统疾病有关[18]。此外，肝豆状核变性的表型还可能受修饰基因、表观遗传学、膳食铜摄入量、铜应激处理能力和金属硫蛋白诱导性的影响[19]。虽大部分研究认为，基因型与表型存在一定的相关性，但也有文献报道，ATP7B基因突变与个体临床表型无明显相关性[20]。因此，基因型与表型的关系仍有待进一步探索。

综上所述，本研究发现1个新的ATP7B致病突变(G1030Wfs*39)，探讨了基因型与表型的关系。但本研究未能深入探讨ATP7B新突变的致病机制而存在一些不足。因此，在今后的工作中会进一步明确各个突变的真实致病性及致病机制，进而在此基础上采取针对性的治疗，以提高临床疗效。