诱导多能干细胞向肝脏细胞分化的研究进展

陈金梅 姚婷 陈小华

2007年，Yamanaka团队通过四种转录因子(Oc4、Sox2、Klf4和c-Myc)将人类真皮成纤维细胞重编程为诱导多能干细胞(iPSC)，从而开启了一个医学和生物科学技术领域的新时代。iPSC具备干细胞的自我更新和多能分化特征，在一定条件下可以分化成多种细胞谱系，重现细胞发育的生物信息，反映人类疾病的发生发展进程，用来预测药物对人体的靶器官毒性和作用机制，在药物筛选方面具有广泛的应用前景。2009年，Song等通过模拟人体的肝脏胚胎发育过程，首次将人诱导多功能干细胞定向诱导分化为肝细胞样细胞(HLC)，并且在肝细胞标志物和功能的表达上与hESC来源肝细胞相当[1]。在小鼠模型中，hiHEP具有在体内整合到肝实质的能力，使其成为再生医学的潜在来源[2]。

iPSC可从成体细胞直接诱导而成，避免破坏胚胎所引起的伦理问题，完全不受来源限制，同时iPSC具有与其来源相同的遗传背景，极大地解决了免疫排斥问题。但干细胞来源的肝细胞分化效率低、诱导过程复杂、费用昂贵、致瘤性及免疫原性，极大地限制了其在临床和科研实践中的应用。

一、分化方案

(一)外源诱导剂 总体上，分化原则是模拟肝脏的胚胎发育，使细胞分化遵循自然发展途径。最初是以时间依赖的方式使用不同的生长因子作为调控细胞生长的发育信号，如激活素-A、成纤维细胞生长因子(FGFs)、骨形态发生蛋白(BMP)、肝细胞生长因子(HGF)和肿瘤抑制素-M(OSM)等，但分化而来的细胞通常表达不成熟的肝脏细胞表型(即表达早期标志物以及低水平的成熟肝脏细胞标志物和细胞色素P450活性[3])。

干细胞的肝脏分化主要分成三个阶段：定形内胚层、肝祖细胞形成、类肝细胞成熟。干细胞的多能状态由TGF-β/Activin/Nodal和FGF信号通路维持。一方面FGF和Activin A刺激PI3-K /GSK3β信号上调多能基因NANOG的表达，维持iPSC的未分化状态[4]。另一方面激活素-A与nodal受体结合，模拟nodal信号诱导内胚层分化[5]。体外实验中，在BMP4和其他PI3K抑制剂的辅助下，高剂量的激活素A能够抑制多能基因的表达并成为内胚层分化的诱导信号[6]。同时，有研究者发现在激活素存在的情况下，内胚层可以继续发育为肝祖细胞[5]。BMP与激活素A同是TGF-β家族成员，在胚胎发育，细胞增殖和分化中起着重要的作用[7]。其中BMP4、BMP10是分化中常用的细胞因子，以Smad和MAPK信号途径介导中胚层和内胚层的产生[8]。肝谱系成熟通常使用HGF和OSM，前者在体内由非实质细胞产生，是促进肝再生的重要因子[9]。而OSM通过激活STAT3信号促进肝细胞的发育成熟[10]。

生长因子价格昂贵，在一定程度上限制了大规模诱导的开展。一些相对低价且有效的小分子物质(SMs)引起人们的关注。糖原合成酶激酶(GSK)-3抑制剂CHIR99021、磷酸肌醇3-激酶(PI3Ks)抑制剂LY294002、HGF受体激动剂N-己酰基-Ile-(6)氨基己酰胺和CYP3A诱导剂(地塞米松)分别被用于定形内胚层分化、肝祖细胞形成和肝细胞成熟。有学者通过SMs成功分化出hiHEPs，并且hiHEPs在总体基因和肝标志物表达方面与生长因子分化的肝脏细胞相似[11]。与其他方法相比，基于小分子的肝脏细胞分化方案具有简单、稳定、安全和可重复性的优势。

(二)培养条件 随着对肝脏分化的研究不断深入，有学者将干细胞与非实质细胞(内皮细胞、成纤维细胞)共同培养产生表型上更接近成人的肝脏细胞[12, 13]。尝试使用不同的天然或合成的支架维持细胞分化的三维空间结构，肝脏细胞可在该结构中诱导生长，同时可再现真实的细胞外基质条件，促进营养物质、氧气和其他因素的输送。目前已经开发了多种可降解生物相容性支架材料，包括天然(胶原蛋白、明胶、等)、合成(聚乳酸、聚乙二醇和聚乳酸聚乙醇酸(PLGA)等)材料[14]。一些纳米材料，包括水凝胶纤维[15]、3D可灌注芯片系统[16]、石墨烯基3D支架[14]、电纺纳米纤维[17]等因其优越的理化性质(孔径、硬度、弹性、导电性)也被用作细胞的支架，最大程度地降低对细胞的潜在危害。细胞外基质成分是理想的支架材料，肝脏脱细胞生物支架的出现保留了完整的血管网络和天然的细胞外基质[18]，比人工合成的支架有更大的优势，为组织工程肝脏的研究带来新的方向。

肝脏组织工程研究日新月异，细胞和支架的结合开启了将多种器官特异性细胞类型整合到单一结构器官的时代，重现人类肝脏的生理和微观解剖结构，即所谓的类器官。2001年Michalopoulos等采用成年大鼠的肝脏细胞经胶原酶分离后维持在肝细胞培养基与生长因子中，经历一系列复杂的变化后，最终产生具有胆管上皮细胞、肝细胞和内皮细胞的组织结构[19]。Takebe等利用iPSC来源肝细胞与人脐静脉内皮细胞和人间充质干细胞在基质胶涂板层上共培养，产生最初的iPSC源性肝细胞类器官[20]。Guan利用iPSC产生具有肝胆结构的肝类器官[21]。比起传统的2D培养，肝脏类器官增加了体外肝脏培养系统的复杂性，弥补体外细胞培养和真实组织之间的差距，并可长期扩增、冷冻保存。更为重要的是，在动物试验中类器官实现了血液循环和功能表达的统一。

三、应用前景

虽然iPSC具体的诱导分化方案依据实验目的或者条件有所不同，但其终极目标都是产生具备相应结构和功能的肝脏细胞并应用于临床，以探索疾病的发病机制及潜在的治疗方案(图1)。

图1 hiHEP的分化过程及应用

(一)药理学研究 hiHEP具有细胞色素P450活性，适用于研究药物代谢和药物毒性检测。一方面，由于iPSC的遗传特异性，hiHEP可以研究肝脏药物代谢能力和药物反应个体间差异[22]。另一方面，hiHEP评估药物对肝细胞形态和生存能力的影响，在进入临床试验之前可发现潜在的肝毒性，从而提高药物开发效率[23]。

(二)细胞治疗 肝细胞移植是目前终末期肝病的有效治疗手段，但肝细胞来源有限、分离细胞质量差和免疫排斥反应限制了它的应用。在再生医学领域，有研究人员已提出使用来源于hPSC的细胞再生替代受损组织，以实现功能恢复。hiPSCs尤其具有产生分化的患者特异性细胞、允许自体细胞移植以及理论上减少免疫排斥风险的重要优势。2014年对一名患有渗出性年龄相关性黄斑变性(AMD)的日本妇女进行了第一次基于iPSC细胞疗法的人体临床试验，该患者右眼被植入了视网膜色素上皮细胞(RPE)片，术后1年右眼的最佳矫正视力在没有接受常规治疗的情况下未改善也没有恶化，且2年内没有发生免疫排斥等严重不良反应[24]。2018年，程刚等利用hiHEP治疗肝纤维化大鼠，移植后4周大鼠肝损伤程度及肝功能有明显改善[25]。最近的临床前研究表明，hiHEP移植也改善了遗传性肝病和ALF的预后[26, 27]。随着基因组编辑技术的发展，人们通过使用核酸酶和成簇的有规律间隔的CRISPR/Cas系统对目标基因进行修饰和校正，而iPSC技术和基因编辑技术联合应用为一些单基因遗传代谢性肝病的“基因矫正”提供了希望[21, 28]。

(三) 体外疾病模型 疾病建模是另一个重要的生物医学应用。来源于不同患者的特异性iPSC分化为功能成熟的肝脏细胞，可构建遗传性肝病模型，如AAT病[29]、家族性高胆固醇血症[30]、糖原贮积病1a型[31]、Wilson病(ATP7B缺乏)[32]、家族性甲状腺素运载蛋白淀粉样变性[33]等，模拟疾病的病理过程，为药物研发寻找新的思路。

hiHEP也广泛应用于嗜肝病毒感染中。使用人类多能干细胞诱导分化HLC，能够表达肝细胞标记物和对乙肝病毒(HBV)感染重要的宿主因子，再现病毒的生命周期和病毒诱导的肝功能障碍[34-36]。hiHEP同样表达已知的参与丙肝病毒(HCV)进入的丙肝病毒宿主受体(Claudin-1、Occludin、SR-BI、CD81)，并支持丙肝病毒基因型2a长达21天的完整生命周期[37]。戊肝病毒(HEV)[38]、寨卡病毒(ZIKV)[39]感染的肝脏模型也已经开发出来。同时来自不同供体的iPSC是个体化肝炎研究与治疗的可靠模型。经脂肪酸处理过的hiHEP可以诱导出非酒精性脂肪肝表型，从而鉴定肝脂肪变性相关的肝标记物和调节通路[40]。

四、总结与展望

尽管iPSC为肝脏疾病带来了新曙光，但目前的分化方案衍生出的HLC仍然与人类成熟肝细胞有一定差距。同时iPSCs中检测到的基因组易位将产生融合蛋白和新的免疫原性决定簇，直接或间接促进体内免疫原性和致瘤性，引发安全问题[41]。尽管种种限制，我们仍需要竭尽全力寻找新的方案，将干细胞分化为具有表型稳定性且无致瘤风险的功能性和可移植性细胞。相信随着分化技术及材料的进一步发展与成熟，hiHEP势必将在临床应用上取得更大的突破。