苗药凤仙花的提取工艺优选及质量标准的研究*

陈桃香，吴海燕，李春宁，胡成刚

(贵州中医药大学药学院，贵州 贵阳 550025)

凤仙花来源于凤仙花科凤仙花属植物凤仙花ImpatiensbalsaminaL.全株，又称指甲花，其种子称急性子，被收载于2020版中国药典。凤仙花是苗族常用的一味药材，在苗医理论中，其味麻辣，性热，入冷经，快经，半边经，有小毒。它具有活血化瘀、止痛解毒、祛风除湿接骨等功效。用于治疗喉蛾，痞块不消，骨鲠，噎食不下。茎常用于治疗骨折，骨质增生；花常用于治疗甲癣[1]。凤仙花资源丰富，全国有270余种，主要分布在我国西南地区[2～4]。本实验对凤仙花提取工艺进行了优化并建立了其质量标准，以期开发和利用凤仙花植物资源，为临床合理应用提供科学依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器

岛津LC-2030C液相色谱仪(自动进样系统、在线排气、紫外检测器)；MODEL BX43F 光学显微镜(配成像系统)；电子天平(型号：FA1004N，厂家：上海菁海仪器有限公司)；电热鼓风干燥箱(型号：GZX-9070MBE，厂家：上海博迅实业有限公司医疗设备厂)；恒温水浴锅(型号：HWS-24型，厂家：上海一恒科学仪器有限公司)；真空干燥箱(上海博迅实业有限公司)；人工智能气候箱(型号：RQX-400B，厂家：常山市华普达教学仪器公司)；硅胶G薄层板。

1.2 材料

凤仙花药材均采自贵州省，共10个批次(详细信息见表1)，由贵州中医药大学药学院标本馆胡成刚教授鉴定为凤仙花科凤仙花属植物凤仙花ImpatiensbalsaminaL.全株。2-甲氧基-1，4-萘醌对照品(批号：S20F719925，厂家：上海源叶生物科技有限公司，含量≧98%)，正己烷、乙酸乙酯、甲酸、苯、甲醇、庚烷、三氯甲烷、磷钼酸均为分析醇。

表1 药材样品信息表Tab.1 Information of the medicinal materials

2 方法与结果

2.1 性状鉴别

凤仙花的全株分根、茎、叶子、花、果实和种子六个部分。叶互生，最下部叶有时对生；叶片披针形、狭椭圆形或倒披针形。花单生或2～3朵簇生于叶腋，无总花梗，白色、粉红色或紫色，单瓣或重瓣。蒴果宽纺锤形，长10～20 mm，两端尖，密被柔毛；种子多数，圆球形，直径1.5～3 mm，黑褐色。

2.2 显微鉴别

粉末呈黄绿色，可见少量单细胞和多细胞的非腺毛，有较多的草酸钙针晶及晶鞘纤维，多见草酸钙方晶及簇晶，各种导管及纤维束多见，有少量椭圆形花粉粒，表面可见网状雕纹，叶碎片少许，表面可见平轴式气孔。结果见图1。

图1 凤仙花药材粉末显微鉴定图Fig.1 Microscopic identification of Impatiens balsamina powder

2.3 薄层鉴别

2.3.1 供试品、对照品溶液的制备

精密称取凤仙花药材粉末5 g，加入95%的乙醇50 mL回流提取两次，每次1 h，过滤，合并两次滤液，即得供试样品提取液[5]。精密称取2-甲氧基-1，4-萘醌对照品5 mg，加入甲醇制成10 mL，使其充分溶解，即得0.5 mg/mL的对照品溶液。

2.3.2 方法

按照2015版中国药典四部通则薄层色谱法(通则0502)[6]，分别吸取2-甲氧基-1，4-萘醌对照品溶液和凤仙花的供试品溶液适量，点于已经活化及饱和后的硅胶G薄层板上，以苯-甲醇(9∶1)为展开剂，展开，取出，晾干后，以磷钼酸为显色剂进行检视，结果见图2。在硅胶板上，槲皮素对照品溶液与不同产地的马桑样品在相应位置显示清晰颜色相同的荧光斑点，分离效果及重复性良好，具体见图2。

图2 凤仙花薄层鉴别图Fig.2 Thin-layer identification of Impatiens balsamina

2.4 检查与浸出物的测定

按照2015版中国药典中各通则项下的实验要求，通则0832水分测定法(烘干法)、2302灰分测定法(总灰分和酸不溶性灰分测定法以稀盐酸测定酸不溶性灰分)、2201浸出物测定法(热浸法测定醇溶性浸出物，以40%乙醇为溶剂)测定[6]，结果见表2。

表2 样品水分、总灰分酸不溶性灰分和浸出物含量测定结果(%，n=3)Tab.2 Determination results of contents of water，total ash，acid-insoluble ash and extract(%，n=3)

2.5 提取工艺的优化

根据前期单因素试验结果，选取提取溶剂的浓度(A)、料液比(B)、提取时间(C)作为考察因素，以提取出的凤仙花2-甲氧基-1，4-萘醌含量为评价指标，利用L9(34)正交试验设计，优选最佳工艺。正交试验与水平因素见表3，正交试验见表4，方差分析结果见表5。

表3 因素水平表Tab.3 Factor-level table

表4 正交试验表Tab.4 Orthogonal testresults

表5 方差分析表Tab.5 Analysis of Variance

试验结果表明，影响凤仙花提取工艺的因素大小顺序为提取溶剂浓度(A)>料液比(B)>提取时间(C)。得到凤仙花最佳提取工艺为A3B3C2，具体操作为：精密称取凤仙花药材粉末1 g，用纯甲醇100 mL，每次提取时间为1 h。

2.6 2-甲氧基-1，4-萘醌的含量测定研究

2.6.1 色谱条件

COSMOSIL Cholester C18色谱柱(4.6×250 mm，5 μm)，流动相：A相为纯水，B相为乙腈；梯度洗脱：0～5 min，10%～35%(B)，5～15 min，35%～35%(B)，15～20 min，35%～65%(B)，20～21 min，65%～10%(B)，21～30 min，10%～10%(A)检测波长：280 nm；柱温：30 ℃；流速：1.0 mL/min；进样量：10 μL。色谱图见图3。

图3 2-甲氧基-1，4-萘醌色谱图Fig.3 Chromatogram of 2-methoxy-1，4-naphthoquinone

2.6.2 供试品溶液的制备

精密称取凤仙花药材粉末1 g，加入100 mL的甲醇溶液，称定重量，在90 ℃下回流提取1 h，放冷至室温，称定重量[7]，用甲醇补足减失的重量，摇匀，用干燥的滤纸过滤后，续滤液用0.45 μm的微孔滤膜过滤后即得供试品溶液[8]。

2.6.3 线性关系考察[9]

精密称取2-甲氧基-1，4-萘醌对照品适量，加甲醇配成0.06 mg/mL溶液，稀释成5个质量浓度(0.003 mg/mL、0.018 mg/mL、0.03 mg/mL、0.042 mg/mL、0.054 mg/mL)，各吸取10 μL，平行3份，按“2.6.1”项色谱条件下测定，以峰面积为纵坐标(Y)，2-甲氧基-1，4-萘醌质量浓度为横坐标(X)进行回归，得到回归方程为Y=6×107X-16256(r=0.9997)，在3.4～54.0 mg/mL范围内线性关系良好。

2.6.4 精密度试验

精密吸取同一对照品溶液10 μL，按“2.6.1”项下的色谱条件，连续进样6次，得到2-甲氧基-1，4-萘醌峰面积RSD为0.22%，仪器精密度良好。

2.6.5 稳定性试验

取同一批供试品溶液，按“2.6.1”项下的色谱条件，根据0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h分别进样10 μL，测得2-甲氧基-1，4-萘醌峰面积RSD为1.5%，表明供试品溶液在12 h内稳定。

2.6.6 重复性试验

取同一批号药材粉末6份，按“2.6.2”项下制备供试品溶液，根据“2.6.1”项下色谱条件，注入色谱仪中测定，得到2-甲氧基-1，4-萘醌含量的RSD为0.53%，表明该方法重复性良好。

2.6.7 加样回收试验

精密称定同一批次凤仙花药材粉末0.5 g，共6份，每份精密加入对照品0.3 mg，按“2.6.2”项下方法制备供试品溶液，进样10 μL测定，计算回收率，结果见表6。

表6 加样回收率试验结果(n=6)Tab.6 Spiked recovery rate(n=6)

2.6.8 样品含量测定

精密称取各产地凤仙花粉末1 g，平行3份，按“2.6.2”项下制备供试品溶液，在“2.6.1”项色谱条件下进样10 μL测定，实验结果见表7。

表7 凤仙花的含量测定结果(n=3)Tab.7 Determination results of Impatiens balsamina(n=3)

3 结论与讨论

本次研究分别从定性鉴别、定量测定两部分对凤仙花进行了研究，凤仙花药材粉末中特征明显，可作为鉴定凤仙花药材真伪的鉴定依据。结合参考文献及药典其他药材检查，暂定凤仙花各检查指标含有量为水分不超过17.0%，总灰分不超过22.0%，酸不溶性灰分不超过0.33%，醇溶性浸出物不低于17.0%。

凤仙花主要含黄酮醇类及萘醌类衍生物，其中2-甲氧基-1，4-萘醌为凤仙花所含成分中最主要的抗真菌化学成分[10]，而且凤仙花的根中还含有指甲醌、东莨菪素等，具有抗真菌、抗过敏、抗炎镇痛等作用[10-12]。凤仙花是苗族民间用于治疗烂癣、顽癣、手足气等疾病的常用药，基于开发治疗皮肤癣类疾病苗药新制剂，故选用2-甲氧基-1，4-萘醌作为质量控制的指标。

本实验，考察了提取溶剂浓度、提取时间、料液比等3个单因素，在单因素考察的基础上，运用正交试验设计方法优选出凤仙花2-甲氧基-1，4-萘醌成分提取的最佳提取方法为甲醇、料液比为1∶100，提取时间为1 h。考察了不同的流动相(甲醇-水、乙腈-水)，发现后者分离效果优于前者，故采用乙腈-水进行梯度洗脱。紫外扫描显示，最大吸收波长位于280 nm，故将其作为检测波长。