哈茨木霉和葡萄座腔菌对亚甲基蓝染料的脱色试验初报

魏鸿锦，吴林应，尚晓静，侯 瑞

（贵州大学，贵州贵阳 550025）

亚甲基蓝（Methylene blue）是一种噻嗪类染料，已被广泛应用于纺织品和纸张的染色。其污水已被证实可引发多种疾病，如休克、黄疸、组织坏死、呕吐、眼灼伤、恶心、头晕等[1]。因此，如何高效处理染料废水，已成为全世界关注的主要问题之一[2]。目前处理染料废水的方法主要分为物理法、化学法和生物法3类[3]。其中生物法运行成本低，绿色环保，具有较大的研究价值。现有研究显示，具有脱色染料功能的生物有细菌、真菌和藻类等[4]。杨春霖研究发现黄丝衣霉菌（Byssochlamys Fulva）对亚甲基蓝染料废水具有良好的脱色效果[5]；张桐等人研究的一栓孔菌ZT-197（Trametes versicolor）对亚甲基蓝染液的脱色率高达98%[6]。

木质素降解酶作用是生物脱色的主要机制，木质素降解酶包括：漆酶（laccase，Lac）、木质素过氧化物酶（lignin peroxidase，LiP）和锰过氧化物酶（manganese peroxidase，MnP）[7]。漆酶具有较强的氧化还原能力，可对多种染料进行脱色[8]，木质素过氧化物酶和锰过氧化物酶是两种常见的过氧化物酶，能够有效分解木质素和多种有机物[9]。木霉菌是目前产纤维素酶量最高的菌株，能够有效降解纤维素[10-11]。有效利用纤维素酶，将纤维素转化成人类可利用的能源十分重要[12]。

本试验从女贞树树干上分离得到菌株B7，从杨树树干上分离得到菌株N38，并对其进行固体脱色筛选。菌株B7、N38 对孔雀石绿、亚甲基蓝的脱色效果均为明显。在进行固体培养基脱色筛选时，两株菌株在添加孔雀石绿染料的培养基里生长速度明显慢于其他染料培养基，因此选择对亚甲基蓝进行脱色优化试验。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 菌株

N38、B7菌株均来源于贵州大学校园内杨树、女贞树枝干，通过真菌分离法获得，于4 ℃冰箱中保存备用。

1.1.2 培养基

PD 培养基：马铃薯200 g，蒸馏水1 000 mL；PDA 培养基：马铃薯200 g、葡萄糖20 g、琼脂18 g、一次蒸馏水1 000 mL；PDB 培养基：马铃薯200 g、葡萄糖20 g、蒸馏水1 000 mL；碳源筛选培养基：添加可溶性淀粉、麦芽糖、葡萄糖、麦芽糖、果糖作为碳源，分别添加20 g·L-1至PD 培养基中，pH 未调节；氮源筛选培养基：添加硝酸钠、氯化铵、硫酸铵、蛋白胨、尿素作为氮源，分别添加1.0 g·L-1至PDB 培养基中，pH 未调节；金属源筛选培养基：添加硫酸锌、硫酸钾、硫酸铁、硫酸镁、硫酸锰作为金属源，分别添加1.0 g·L-1至PDB培养基中，pH未调节。

1.1.3 染料与试剂

活性染料：活性黑、活性红；碱性染料：孔雀石绿、亚甲基蓝、刚果红、结晶紫；酸性染料：铬黑T。次氯酸钠溶液、无水乙醇、75%酒精、蒸馏水。

1.2 方法

1.2.1 菌株形态学鉴定

在超净工作台中，用9 mm 的无菌打孔器截取已活化的菌株B7、N38 的菌柄至新的PDA 固体培养基上，在28 ℃恒温箱中避光培养，记录菌落的生长情况（形态、直径）[13]。培养6 d 后，用光学显微镜进行形态学观察、鉴定，参照《真菌鉴定手册》[14]。

1.2.2 菌株分子生物学鉴定

提取菌株的DNA 时使用Plant Direct PCR Kit(Finnzymes，Finland)真菌DNA 提取试剂盒，通过PCR扩增得到引物ITS1 和ITS4[15]。并送至重庆擎科兴业生物技术有限公司进行测序。同时从NCBI 获得相关可靠的结果进行比对，利用MEGA7.0对上述分子序列进行多序列比对，采用MEGA7.0 中邻接法（Neighbor joining，NJ）构建系统进化树，并结合菌株的形态特征证实该菌株的物种种类[16]。

1.2.3 菌株B7、N38 漆酶、木质素过氧化物酶和锰过氧化物酶活性测定

将70 mL PDB 分别装入250 mL 的三角瓶中，高温下用低压的热蒸汽在每个灭菌锅121 ℃下，灭菌30 min 后在每个新的三角瓶内分别重新接入4 片菌柄(d=9 mm)后并置于每一个新的三角瓶中，置于28 ℃下的恒温中心后进行一次避光灭菌培养，将第2 d、4 d、6 d、8 d 和10 d 的发酵液吸取1.0 mL，再将其进行5 min 转速为7 000 r·min-1的离心，然后用紫外分光光度计测定其酶活性。

Lac 活性测定[17-18]：将PH 值为5 的1.95 mL 羟基柠檬酸-羟基磷酸氢二钠缓冲液、1.0 mmol·L-12,2′-联氮-双-3-乙基苯并噻唑-6-磺酸[2,2′-azinobis-(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate)，ABTS]和0.05 mL 的上清发酵液置于30℃的电热水浴中3 min 后，测定它在3 min 内420 nm 处的强度吸光剂在照射下的强度及其值的变化改变，每个测定过程及其中的吸光处理均需要重复3 次。一个氧化酶的生物活力学计量单位(U)被定义为每分钟可以通过酶催化底物氧化1.0 μmol ABTS 底物时所需酶的总数量（ABTS：ε420=3.6×104L·mol-1·cm-1）。

MnP 活性测定光剂[18-19]：0.84 mL 上清浓度为0.05 mol·L-1的羟基丙二酸钠盐水溶液、0.05 mL 上清浓度为0.01 mol·L-1的硫酸锰溶液、0.05 mL 上清浓度为0.01 mol·L-1的2,6-二甲氧基乙酰苯酚(2,6-dimethoxyphenol，2,6-dmp)、0.05 mL 上清浓度发酵液和0.01 mL 上清浓度按照比例测量为0.01 mol·L-1的双氧水装入一个吸光比色皿中，测定1 min 内468 nm内皿处的各种吸光剂在照射下的强度和数值的活性变化，每个比色皿中的强度处理均匀后可以同时重复3 次。一个氧化酶的整体活力学计量单位(U)被定义为每分钟可以通过催化底物氧化1.0 μmol 2,6-dmp底物的整体所需氧化酶量（2,6-DMP：ε468=4.68×104L·mol-1·cm-1）。

LiP 活性测定[6,18]：将混合后的溶液1.7 mL 浓度相差为0.25mol·L-1的四水合酒石酸钾钠溶液和0.05 mL浓度相差为0.1 mol·L-1的藜芦醇(veratryl alcohol，VA溶液置于30 ℃的水浴中进行预热后，依次在锅中加入0.05 mL 上清发酵液和浓度为0.1mol·L-1的0.05 mL 双氧水，测定其在3 min内310 nm 处吸光光度值的变化，每个处理均重复3 次。一个酶的活力学单位(U)被定义为每分钟可以通过催化氧化1.0 μmol VA 物所需酶量（VA：ε310=9.3×103L·mol-1·cm-1）。

1.2.4 固体培养基脱色筛选

添加50.0 mg·L-1活性红、活性黑、孔雀石绿、刚果红、亚甲基蓝、铬黑T、结晶紫至PDA 培养基中，121 ℃下高温高压蒸汽灭菌30 min。在超净工作台中将加入不同染料的PDA（20 mL）倒入直径90 mm 的培养皿中，用9 mm 的无菌打孔器截取已活化菌株B7、N38 的菌柄至不同染料的PDA 固体培养基上，上述操作重复3 次。再做一组不接菌的空白对照，每个染料作一组空白对照（7组）。在28 ℃恒温培养箱避光培养10 d，根据接菌组的脱色圈大小及颜色变化与对照组相比较，计算菌株B7、N38 对不同染料的脱色率，RD为染料脱色率，A1为脱色圈直径，A0为对照组染料区域直径，计算公式为：RD（%）=A1/A0×100[20]。

1.2.5 碳源种类对菌株B7、N38脱色亚甲基蓝的影响

添加麦芽糖、葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉、果糖作为碳源，分别添加20 g·L-1的碳源至染料终质量浓度50.0 mg·L-1的PD 培养基作为碳源筛选培养基，在100 mL 三角瓶中装入50 mL 碳源筛选培养基。以同样浓度的PD染料培养基作为对照组。

1.2.6 氮源种类对菌株B7、N38脱色亚甲基蓝的影响

添加硝酸钠、氯化铵、硫酸铵、蛋白胨、尿素作为氮源，分别添加1.0 g·L-1的氮源至染料终质量浓度50.0 mg·L-1的PDB 培养基作为氮源筛选培养基，将50 mL 氮源筛选培养基装入100 mL 三角瓶中。以同样浓度的PDB染料培养基作为对照组。

1.2.7 金属源种类对菌株B7、N38脱色亚甲基蓝的影响

添加硫酸锌、硫酸钾、硫酸铁、硫酸镁、硫酸锰作为金属源，分别添加1.0 g·L-1的金属源至染料终质量浓度50.0 mg·L-1的PDB 培养基作为金属源筛选培养基，将50 mL 金属源筛选培养基装入100 mL 三角瓶中。将同样浓度的PDB染料培养基作为对照组。

1.2.8 装液量对菌株B7、N38脱色亚甲基蓝的影响

将浓度为50.0 mg·L-1PDB 染料培养基分装90.0 mL、70 mL、50 mL、30 mL、10 mL 于100 mL 三角瓶瓶中。

1.2.9 pH值对菌株B7、N38脱色亚甲基蓝的影响

将PDB培养基染料浓度调至50.0 mg·L-1，分别倒入100 mL三角瓶中，高温高压蒸汽灭菌30 min。在超净工作台中用已灭菌的过滤器过滤NaOH、HCL，用NaOH、HCL将培养基调整为pH3、pH5、pH7、pH9、pH11。

1.2.10 染料吸光值的测定、脱色率的计算及数据分析

分别取4 片菌柄（d=6 mm）于上述三角瓶中，重复3次。28 ℃恒温培养箱中避光培养10 d，每2 d在超净工作台中取1.8 mL 染料发酵液，经1 2000 r·min-1离心2 min，取1.0 mL 上清液于紫外分光光度计波长为662 nm 测量其OD 值。液体染料脱色公式为RD=（C0-C1）/C0×100%[17]。C0为未接菌PDB 染料培养基的光度值，C1为已接菌的染料发酵液，RD为液体染料脱色率。

2 结果与分析

2.1 菌株N38和B7形态学观察、DNA的提取及ITS系统发育树的构建

菌株N38 和B7 于恒温培养箱中，4 d 即可长满培养皿（见图1）。提取菌株B7、N38 的DNA 后，进行引物扩增得到PCR 产物送其测序，构建系统发育树（见图2）。获得测序结果后登录网站GenBank，得到菌株N38 的登录号MZ461912.1，菌株B7 的登录号OK021633.1。

图1 菌株N38、B7的菌落形态学观察

图2 基于ITS序列的系统发育树

2.2 漆酶、木质素过氧化物酶和锰过氧化物酶的活性变化

培养第2 d 开始监测菌株N38 产酶活性，其酶活性随时间的增长呈现先增长再降低的趋势。Lac 活性在第8 d 时达到峰值，其酶活力为9.27 U·L-1；MnP 活性也在第8 d 达到最大值，为16.53U·L-1；而LiP 活性在第6 d达到最大值，为7.66U·L-1（见图3a）。

培养第2 d 开始监测菌株B7 产酶活性，其酶活性随时间的增长呈现先增长再降低的趋势。Lac 活性与MnP 活性均在第6 d 达到峰值，其酶活力分别为13.31 U·L-1、11.29 U·L-1；LiP 活性在第8 d达到峰值，为5.24 U·L-1（见图3b）。

图3 漆酶、木质素过氧化物酶、锰过氧化物酶的活性变化

2.3 菌株B7、N38对7种分属不同类别染料脱色筛选

将菌株接种在添加孔雀石绿、刚果红、铬黑T、活性黑、活性红、结晶紫、亚甲基蓝的固体染料培养基上。观察后发现，菌株B7对孔雀石绿和亚甲基蓝脱色都很明显，脱色率分别为92.78%、92.22%，对剩余染料的脱色率由高到低依次为：结晶紫（79.22%）、铬 黑T （64.44%）、活 性 红（50.00%）、刚 果 红（44.44%）、活性黑（41.11%）（见图4a）；菌株N38 对亚甲基蓝的脱色效果最佳，脱色率为92.78%，对活性红、结晶紫、刚果红三种染料脱色率相同，均为88.89%，对剩余染料的脱色率由高到低依次为：孔雀石绿（82.22%）、活性黑（5.00%）、铬黑T（3.33%）（见图4b）。

图4 菌株对7种染料的脱色率

2.4 菌株N38、B7脱色亚甲基蓝受碳源种类的影响

脱色第10 d，添加葡萄糖作为碳源时的脱色效果最好，脱色率达84.92%；其次果糖与麦芽糖效果较为接近，脱色率分别为73.38%、70.43%；蔗糖和淀粉脱色率略低，依次是68.64%、48.13%。依结果可见淀粉作为碳源对N38 脱色效果并不佳，与其他碳源差距明显（见图5a）。

脱色第10 d，添加葡萄糖作为碳源时的脱色效果最好，脱色率达83.01%；果糖、蔗糖与淀粉效果较为接近，脱色率分别为77.99%、70.74%、69.57%；麦芽糖脱色率最低，仅54.66%。结果显示麦芽糖作为碳源对N38 脱色效果不佳，与其他碳源差距明显（见图5b）。

图5 碳源对菌株脱色亚甲基蓝的影响

2.5 菌株N38、B7脱色亚甲基蓝受氮源种类的影响

五种氮源中，以氯化铵为氮源的脱色效果最佳，脱色率为93.21%；添加蛋白胨与尿素脱色效果次之，脱色率依次为74.28%、76.12%；添加硫酸铵的脱色率为65.09%；而硝酸钠添加后脱色效果最差，脱色率为54.34%。综上所述，添加氯化铵作为氮源对菌株N38脱色亚甲基蓝效果明显（见图6a）。

五种氮源中，以硝酸钠为氮源的脱色效果明显，脱色率为80.31%；添加蛋白胨，脱色效果次之，脱色率为75.44%；添加尿素、氯化铵和硫酸铵的脱色效果明显降低，脱色率依次为：27.17%、25.38%、15.29%。综上所述，添加硝酸钠作为氮源对菌株B7脱色亚甲基蓝效果明显（见图6b）。

图6 氮源对菌株脱色亚甲基蓝的影响

2.6 菌株N38、B7脱色亚甲基蓝受金属离子种类的影响

镁离子的添加对菌株N38脱色亚甲基蓝效果最佳，脱色率为88.80%；其余四种金属离子脱色效果都较为接近，添加锌离子、铁离子、锰离子、钾离子为金属源对菌株N38 脱色亚甲基蓝效果十分接近，脱色率分别为78.47%、76.60%、76.21%、71.42%（见图7a）。

锌离子的添加对菌株B7脱色亚甲基蓝效果最佳，脱色率为91.18%；钾离子、镁离子脱色效果都较为接近，其脱色率依次是：85.73%、82.78%；添加锰、铁离子作为金属源的脱色率较低，依次为69.93%、59.62%（见图7b）。

图7 金属离子对菌株脱色亚甲基蓝的影响

2.7 菌株N38、B7脱色亚甲基蓝受装液量的影响

装液量为30 mL 时，脱色效果最佳，脱色率为99.11%；装液量为10 mL 时脱色效果也同样很好，脱色率为95.75%；其余3 种装液量脱色效果随着装液量增加，脱色率下降，装液量为50 mL、70 mL、90 mL时，脱色率依次为85.01%、65.41%、50.56%。当装液量达到90 mL 时脱色率明显低于其余4 种装液量（见图8a）。

装液量为10 mL 时，脱色效果最佳，脱色率为90.56%；装液量为30 mL 时脱色效果略低于10 mL 时，脱色率为86.86%；随着装液量增加脱色率不断下降，装液量为50 mL、70 mL 和90 mL 时，脱色率依次为68.59%、67.07%、31.95%。当装液量达到90 mL 时，脱色率明显低于其余4种装液量（见图8b）。

图8 装液量对菌株N38脱色亚甲基蓝的影响

2.8 菌株N38、B7脱色亚甲基蓝受pH值的影响

培养基pH 值不同，菌株的脱色能力也差异显著。当pH 值由3.0 增加至5.0 时，脱色效果明显增加，脱色率由15.88%增加为73.05%；当pH 值为7 时脱色效果最佳，脱色率为77.99%；随着pH 值继续增大时，脱色率下降趋势明显，pH 值为9 时脱色率为14.19%；pH 值为11 时脱色率为10.22%。综上所述，菌株N38在极酸极碱的条件下脱色能力差（见图9a）。

受pH 值的影响，菌株的脱色能力也差异显著。当pH 值为3.0 时，脱色效果最佳，脱色率为97.30%；而pH 值为5 时脱色率为73.99%；当pH 值为7 时脱色率也，脱色率为93.93%；但随着pH 值继续增大时，脱色率下降趋势明显，pH 值为9 时脱色率为13.54%；pH 值为11 时脱色率为13.03%。综上所述，菌株N38在极碱的条件下脱色能力差，培养基pH 值位于3 时，菌株B7脱色亚甲基蓝能力最强（见图9b）。

图9 pH值对菌株脱色亚甲基蓝的影响

3 讨论

本试验从贵州大学校园内的女贞树枝干上分离、纯化得到菌株B7，从杨树树干上分离、纯化得到菌株N38。根据菌株的形态学特征、ITS序列相似性比对以及进化树分析，鉴定B7 为哈茨木霉菌Trichoderma harzianum；N38 为葡萄座腔菌Botryosphaeria dothidea。哈茨木霉为半知菌亚门丝孢纲丛梗孢目科木霉属，广泛分布于森林生态系统中，其适应性极强，对多种病原真菌和细菌都有拮抗作用[21]，是一类重要的生防真菌，广泛存在于空气、土壤以及植物体表面等生境中，具有强适应力、存在范围广和广谱、高效等优点[22]。葡萄座腔菌是一种重要的植物内生菌[23]。通过木质素过氧化物酶的测定，可知两菌株具有一定的脱色能力。B7、N38 的漆酶、木质素过氧化物酶、锰过氧化物酶的酶活峰值出现在6～8 d，与乔乔研究的木质素过氧化物酶的酶活峰值为第6～8 d 结果相同[24]。为了研究两菌株在不同条件下对亚甲基蓝脱色能力，本试验测定了不同碳源、氮源、金属离子、pH值和装液量条件下对菌株脱色亚甲基蓝的影响。结果显示添加葡萄糖作为碳源，菌株N38、B7 脱色亚甲基蓝效果最佳，推测菌株N38、B7 在添加葡萄糖时，可促进其对亚甲基蓝脱色。徐红云在一色齿毛菌的脱色试验中，添加葡萄糖作碳源的脱色效果也最佳[25]；添加氯化铵作为氮源，菌株N38脱色效果最佳。菌株B7在添加硝酸钠作为氮源时，脱色效果最佳。而一色齿毛菌脱色刚果红时，添加硝酸铵作氮源效果最佳[26]，考虑是菌株不同，对氮源的需求也不同；添加硫酸镁作为金属源，菌株N38脱色亚甲基蓝效果最佳。菌株B7在加入锌离子作为金属源时，脱色率高达91.18%。由此可见，金属离子是微生物生长中不可或缺的一部分，少量的金属离子可以促进菌株的生长[27]；培养基pH值为7 时，菌株N38 脱色亚甲基蓝效果最佳。菌株B7在pH 值为5的条件下，脱色效果明显。与周菲结论相对应，其研究的哈茨木霉脱色活性艳蓝KN-R 的最适培养条件为pH 值为5.5[28]，推测pH 值为5 左右时，最适合哈茨木霉生长；当装液量为10 mL 时，菌株N38、B7脱色亚甲基蓝脱色率均达到90%以上。随着装液量的升高，脱色率逐渐降低，印证了姚英等的结论：当装液量为10 mL 时，脱色效果最佳，但是在染液量超过菌株自身承载范围时，脱色效果大大降低[26]。推测菌株对染料脱色有一定的能力范围，因此当接菌量一定时，装液量越少脱色效果越明显。葡萄座腔菌在脱色优化方面暂无报道，在生态发展的时代，微生物降解染料废液备受关注。综合本研究结果，菌株N38、B7可脱色染料亚甲基蓝，这对染料废水的治理具有一定借鉴和指导价值。