生酮饮食对实验性自身免疫性脑脊髓炎的作用及其对NLRP3炎症小体的影响

冯嘉莹，曾 丹，张林坤

0 引 言

多发性硬化(multiple sclerosis，MS)是一种中枢神经系统(central nervous system，CNS)的慢性神经炎症和脱髓鞘性疾病，病因尚未完全阐明，多数研究认为其脱髓鞘和进一步的神经退行性变与神经炎症有关，MS所有阶段均存在浸润和激活的常驻免疫细胞[1]。临床研究表明，MS的进展与CNS内某些细胞因子网络的失调有关[2]。白细胞介素(interleukin，IL)-1β和IL-18是IL-1家族的两个成员，具有广泛的促炎作用，在MS患者中均显著升高，给予药物阻断或基因去除IL-1β或IL-18对实验性自身免疫性脑脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE)的发生具有保护作用[3]。白细胞介素-1β和IL-18作为非活性前体产生，需要半胱天冬酶-1(Caspase-1)的切割才能发挥活性作用，caspase-1激活是由多蛋白复合物的寡聚作用介导的，这些复合物被称为炎症小体，核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(nucleotide binding oligomerization domain-like receptor protein 3，NLRP3)是研究最广泛的炎症小体[4]。NLRP3炎症小体参与感染、代谢紊乱、自身炎症和自身免疫，大量数据证实了EAE小鼠NLRP 3炎症小体的激活，NLRP3缺陷或给予NRLP3抑制剂可减轻EAE小鼠的病情严重程度，表明NLRP3炎性小体可能是MS的潜在治疗靶点[5]。生酮饮食(ketogenic diet，KD)是一种脂肪高比例，碳水化合物低比例，蛋白质和其他营养素合适的配方饮食。国内外研究均显示，生酮饮食疗法安全、简单易行，并对神经系统有保护作用[6-7]。近年来有国外研究表明，KD能阻断细菌细胞组分与模式识别受体的结合后引起的下游炎性通路，进而减少炎性介质控制炎症反应的发生[8]。在我们的前期研究中发现，KD通过抑制CD4+细胞雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)，提高腺苷酸激活蛋白激酶(adenosine 5′-monophosphate -activated protein kinase，AMPK)，调节癫痫患儿外周血中T细胞(包括Th1、Th2、Th17和Treg细胞)免疫功能紊乱，减少炎症因子产生[9]。本研究观察了DK对MS/EAE模型神经元损伤的保护作用及其对NLRP3炎症小体的作用，现将结果报告如下。

1 村料与方法

1.1 试验动物6～8周龄，体重在18～20 g之间的健康清洁级C57BL/6小鼠40只，购自遵义医学院实验动物中心，动物生产许可证号：SCXK(黔)2018-0002，动物饲养于遵义医学院医学与生物研究中心，动物使用许可证号：SYXK(黔) 2011-003。动物饲养于室温(24±2)℃、光/暗12 h交替环境中，自由摄食和洁净饮水，并按实验动物使用的3R原则给予人道的关怀。

1.2EAE模型构建、分组及给药方式40只小鼠采用随机数字表法分为4组，对照组、EAE模型组、KD组和芬戈莫德治疗组(FTY720组)，每组各10只。将髓鞘少突胶质细胞糖蛋白35-55(myelin oligodendrocyte glycoprotein 35-55，MOG35-55)(MOG35-55可诱导自身免疫抗体生成，产生复发-缓解型神经性疾病，表现为大量斑块状脱髓鞘病症，用于诱导EAE模型)。用0.01 mol/LPBS稀释成300 μg/mL，按1∶1加入等量完全弗氏佐剂混合，连接三通管，置玻璃注射器中乳化抗原，制成乳白色粘稠的油包水乳剂。将小鼠称重，用0.6%的戊巴比妥钠注射液按70 mg/kg剂量腹腔注射麻醉。实验组小鼠30只，在腹侧中线脊髓两侧皮下注射0.2 mL抗原乳剂，免疫后第0天和免疫后第2天腹腔注射200 ng百日咳毒素，建模成功。对照组10只，仅注射等渗盐水。免疫后第10天，开始对EAE小鼠用药连续30 d：KD组小鼠喂养KD饲料(喂养KD前禁食24 h)，监测血酮、血糖，其余组普通饲料喂养；FTY720组小鼠，按1 mg/(kg·d)的量进行给药；EAE模型组和正常对组小鼠灌胃等量等渗盐水。

1.3动物发病情况观察从免疫当天开始，每天观察小鼠的精神状况和活动情况，称重并参照5分法评分标准对小鼠进行神经功能评分：0分指无任何症状；1分指尾部无力，存在轻度步态拙笨；2分指轻度后下肢无力，被动翻身后可规复；3分指严重后肢瘫痪，被动翻身后不可规复，但给予刺激后可挪动；4分指四肢瘫痪；5分指濒死状态或死亡。

1.4脾单个核细胞(mononuclear cell，MNC)分离免疫后第40天处死小鼠，取脾，于细胞筛中研磨，细胞匀浆用细胞过滤器过滤，得到脾匀浆。脾匀浆于4 ℃、以离心半径8 cm、1500 r/min离心5 min，收集脾细胞沉淀。加入红细胞裂解液2 mL，室温反应5 min，加入2 mL培养基终止裂解。离心去上清，清洗，得到脾单个核细胞。

1.5流式细胞仪检测Th17 将脾单个核细胞按照每管1×106细胞/管分装于流式管中，用200 μL PBS进行混悬，体外刺激方法：佛波醇乙酯25 ng/mL，离子霉素250 ng/mL，莫能霉素20 ng/mL作蛋白转运抑制剂，4 ℃避光放置30 min；37 ℃,5%CO2下孵育24 h后。经CD3-PC5、CD8-ECD设门，固定破膜，分别经细胞质内IFN-γ-FITC、IL-17A-PE抗体染色30 min，上机检测，细胞质内IFN-γ染色阳性代表Th1细胞，IL-17A染色阳性代表Th17细胞，全部数据经FACS Diva Ver 6.1.3软件获取分析。Treg检测：经CD4-eFloure450设门，固定破膜，分别经细胞质内CD25-PerCP-Cy5.5、Foxp3-APC抗体染色30 min，流式细胞仪检测CD4+CD25+Foxp3+T细胞比例，全部数据经FACS Diva Ver 6.1.3软件获取分析。

1.6细胞因子检测取脾MNCs悬液(每毫升培养液中调整细胞数为 5×106个)给以10 μg/mL MOG35-55刺激后，置于CO2培养箱共培养72 h后，收集细胞上清液，ELISA试剂盒测定A值并计算各组IL-4、IL-17A、肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)及干扰素γ(interferon γ，INF-γ)的含量(pg/mL)。

1.7脑脊髓病理组织学改变在多聚甲醛中固定中枢神经系统组织48 h，反复缓慢清洗组织12 h，再逐级脱水、包埋、最后切片，常规HE染色，于光镜下观察各组动物组织病理变化，炎性细胞浸润严重程度。按照Okuda标准病理组织炎症评分，0分指无改变，1分指炎症限于血管、脑脊膜旁边，2分指实质可见内炎症轻度浸润(1～20个/片)，3分指实质可见内炎症中等度浸润(21～100个/片)，4分指炎症细胞>100个/片。随机选取5个视野计数后取每张切片均值，一只大鼠至少2张切片，将均值作为结果。

1.8实时荧光定量PCR技术检测NLRP3、凋亡相关斑点样蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD，ASC)和caspase-1mRNA表达取单个核细胞，加入细胞裂解液，按Trizol总RNA提取试剂盒说明提取总RNA，使用紫外分光光度计对总RNA纯度和浓度进行检测，以A260/A280在1.80～2.20为合格。使用2-△△Ct法计算外周血NLRP3、ASC和caspase-1 mRNA相对表达量。

2 结 果

2.1 神经功能评分相比较EAE模型组神经功能评分显著高于对照组、KD组和FTY720组(P<0.05)，KD组和FTY720组神经功能评分相比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表 1 各组动物神经功能评分相比较

2.2脾淋巴细胞Th17和Treg细胞比例相比较EAE模型组Th17比例高于对照组、KD组和FTY720组，Treg比例小于对照组、KD组和FTY720组(P<0.05)；KD组和FTY720组Th17和Treg比例相比较差异均无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表 2 脾淋巴细胞Th17和Treg细胞比例相比较

2.3细胞因子水平相比较EAE模型组IL-17A、INF-γ、TNF-α水平高于对照组、KD组和FTY720组，IL-4水平低于对照组、KD组和FTY720组(P<0.05)；KD组和FTY720组IL-4、IL-17A、TNF-α和INF-γ水平相比较差异均无统计学意义(P>0.05)。见表3。

表 3 各组动物细胞因子水平相比较

2.4NLRP3、ASC和Caspase-1 mRNA相对表达水平相比较EAE模型组NLRP3、ASC、Caspase-1水平高于对照组、KD组和FTY720组(P<0.05)；KD组和FTY720组NLRP3、ASC、Caspase-1水平相比较差异均无统计学意义(P>0.05)。见表4。

表 4 各组NLRP3、ASC和Caspase-1 mRNA相对表达水平相比较

2.5脑脊髓HE染色结果对照组脑和脊髓结构完整，细胞质清晰可见；EAE模型组小鼠脑和脊髓内有大量炎症细胞浸润，血管周围有典型的袖状改变；KD组和FTY720组炎症浸润显著改善；与EAE模型组相比较，KD组和FTY720组炎症评分显著降低(P<0.05)。见表5，图1。

表 5 各组动物脑和脊髓炎症评分相比较 分)

图 1 镜下观察各组动物脑和脊髓形态(HE ×200)

3 讨 论

MS是高度致残的中枢神经系统疾病，激素和免疫抑制剂治疗MS有一定疗效，患者长期应用须注意不良反应，包括淋巴细胞减少、多灶性白质脑病和恶性肿瘤等，且复发率高。因此，采用一种相对安全的饮食治疗方案可能更有利。在多发性硬化症患者中，自体侵袭性T细胞透过血脑屏障进入脑与脊髓，与中枢抗原结合，分泌大量细胞因子趋化因子，进一步使外周血T、B细胞、单核/巨噬细胞等进入炎性反应部位，损害中枢神经，诱发中枢神经系统脱髓鞘，导致感觉异常、遗尿、神经炎和共济失调[10]。EAE是一种在动物体内诱导的中枢神经系统炎症性自身免疫性疾病，多种免疫病理机制与神经病理机制的相互作用导致MS的主要病理特征：炎症、脱髓鞘、轴突丢失和胶质化[11]。炎症和髓鞘再生的反调节机制也发生在EAE中，因此可作为这些过程的模型，该动物模型也可用于评估各种免疫调节干预在自身免疫性疾病环境中的有效性，已被广泛应用于实验研究[12]。

本研究结果显示，与对照组相比较，EAE模型组Th17水平升高，Treg水平降低，炎症因子IL-17A、TNF-α、INF-γ水平升高，抗炎因子IL-4水平降低。EAE的发展基础是诱导T细胞对中枢神经系统的自身免疫反应，Th1和IL-17细胞EAE和MS病理相关。已有大量的临床或实验研究确定分泌IL-17的CD4+T细胞(Th17)和分泌IFN-γ的Th1细胞是独立的炎症T细胞群，在自身免疫性疾病的发病机制和抗感染保护中具有明显的互补作用[13-14]。Th1细胞的分化是由IL-12介导的，而IL-23与IL-1起协同作用，在诱导和扩增小鼠或人Th17细胞中起着重要的作用。多项研究表明，Th17细胞是中枢神经系统自身免疫性炎症的“真正”效应。Lunin等[15]研究显示，Th1细胞群的激活之后，Th17细胞在急性EAE发育过程中被激活，从而产生双相细胞因子反应。流式细胞检测发现MS患者外周血单个核细胞 IL-17 表达高于健康对照。在EAE动物模型的研究表明，Th17细胞促进 EAE 的病情发展，敲除小鼠 IL-17 基因，在没有IL-17 参与的情况下，疾病模型的疾病严重程度、病程及预后情况均优于未敲除小鼠的对照模型[16]。Th17与调节性T 细胞(Regulatory T cells,Treg)比例失衡，可能也是引起疾病发病的一个重要机制。髓鞘特异性Th17细胞进入中枢神经系统，分泌IL-17A，通过趋化因子诱导，吸引各种免疫细胞。上调的细胞因子/趋化因子的表达触发活性氧(Reactive oxygen species ,ROS)的产生，随后以反馈的方式促进炎症级联[17]。此外，在EAE和MS中，小胶质细胞和巨噬细胞激活产生的ROS与脱髓鞘和轴突损伤有关。NOD样受体蛋白3(NOD-like receptor protein 3, NLRP3)是一种细胞内模式识别受体，当配体与NLRP3结合后会促进炎症小体的形成，同时对caspase1进行自身激活，最终导致IL-1β和IL-18在机体中成熟及分泌。NLRP3炎症小体参与感染、代谢紊乱、自身炎症和自身免疫，Barclay[18]等研究证实了EAE小鼠NLRP 3炎症小体的激活，并阐明NLRP 3炎症小体通过促进炎症细胞向中枢神经系统的迁移而起到控制疾病的作用。此外，IFNb是治疗MS的一线药物，其作用是抑制NLRP 3炎症小体的激活及其在EAE中的作用，保护小鼠免受该病的侵袭。结合本研究结果提示纠正以抑制NLRP3激活及CD4+T 细胞介导的免疫功能紊乱和T细胞亚群功能失衡，减轻炎症反应和氧化应激，是治疗MS/EAE和降低其复发率的关键。

本研究结果显示，KD组NLRP3、ASC、Caspase-1、Th17、IL-17A、TNF-α、INF-γ水平及炎症评分低于EAE模型组，Treg、IL-4水平高于EAE模型组。KD是模拟禁食状态下产生酮体的饮食治疗方法，在体内代谢过程中产生大量的酮体，包括丙酮、乙酰乙酸和β-羟丁酸，其进入血液后被包括脑在内的器官吸收，并在线粒体中进一步代谢，从而为神经系统内的细胞产生能量。Bae等[19]在动物模型中发现，β-羟丁酸可通过抑制NLRP3炎性小体的产生，减少循环系统中炎症标志物。也有研究证实，β-羟丁酸对NLRP3炎症小体的抑制作用可能与缓解内质网应激有关。这些抗炎特性可以解释KD治疗新发难治性癫痫持续状态和发热感染相关癫痫综合征等继发于自身免疫性脑炎的疗效。Dupuis等[20]研究显示，生酮饮食诱导产生的β-羟丁酸可抑制脂多糖诱导发热动物模型脑组织中NLRP3激活。KD理论上可直接抑制NLRP3炎症小体治疗与炎症小体相关的疾病。结合本研究结果提示，KD可减轻EAE模型小鼠NLRP3诱导的免疫炎症反应。本研究结果显示，KD组神经功能评分和炎症评分均低于EAE模型组，与NLRP3和免疫炎症因子变化趋势一致，进一步提示KD可通过抑制NLRP3诱导的免疫炎症反应改善病情。

综上所述，本研究结果显示，KD可改善EAE模型小鼠的神经功能行为，其中用机制可能是通过抑制NLRP3减轻中枢系统免疫炎症反应。