短链脂肪酸对体外氧化应激诱导的卵母细胞成熟障碍的保护作用

唐 婷，卡迪丽娅·居尔艾特提拜克，赵山美子，马汝钧，陈 莉，姚 兵

0 引 言

卵母细胞的成熟是体外受精(in vitro fertilization，IVF)和卵胞浆内单精子注射(intracytoplasmic sperm injection，ICSI)成功不可或缺的条件，正常卵母细胞及胚胎发育需要体内外多种因素的共同调节，当发生调节失衡可导致卵母细胞及胚胎发育异常，从而影响妊娠结局[1]，而体外培养时的高氧环境会导致卵母细胞体外成熟过程中活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)的激增，进一步通过氧化应激损伤卵母细胞和胚胎的质量[2]。大量的氧化应激可导致卵母细胞内线粒体形态和功能的改变,进而影响三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)合成,干扰卵母细胞内减数分裂，使卵母细胞内非整倍体染色体数目增多，造成胚胎DNA损伤和早期发育停滞，最终导致不良妊娠结局[3]，近年来，氧化应激作为影响卵母细胞的发育潜能的重要机制之一，受到了广泛的关注[4]。

短链脂肪酸(short-chain fatty acids，SCFAs)主要由乙酸、丙酸和丁酸组成，在调节宿主代谢、免疫系统和细胞增殖方面具有关键作用，近年来被广泛研究[5]。SCFAs作为信号分子广泛分布于全身，参与多个系统的病理生理过程，在多种消化系统肿瘤和炎症相关疾病中都强调了SCFAs的保护机制[6]。亦有研究报道，SCFAs可以显著改善肠道和肝的氧化应激和炎症反应[7]。但是SCFAs是否能够调节卵母细胞的氧化应激状态以及在卵母细胞的发育成熟中是否发挥作用，目前尚未有研究报道。

鉴于SCFAs在其他器官组织中具有的抗氧化作用，本研究通过观察卵母细胞成熟率、分析减数分裂超微结构、检测Pi3K/Akt信号通路相关分子，探究了不同浓度和不同类型的SCFAs对氧化应激后小鼠卵母细胞体外成熟的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物健康SPF级6～8周龄ICR雌鼠30只，购自于南京祥鸿生物工程有限公司，动物许可证号：SCXK(苏)2018-0008。饲养在通风笼中，环境保持安静，光照周期：12 h/12 h，温度：20～24 ℃，湿度：50%～70%。

1.2实验试剂和仪器M2培养基、Anti-α-Tubulin-FITC 抗体、乙酸、丙酸和丁酸购自于美国Sigma 公司，2× LaemmLi Sample Buffer和2-Mercaptoethanol购自于美国Bio-Rad 公司，ECL 显影液购自于中国兰杰柯公司，Akt(pan)抗体和Phospho-Akt 抗体购自于美国Cell Signaling Technology公司，HRP-山羊抗兔二抗和Hoechst 33258购于中国碧云天公司，二氧化碳培养箱购自于日本Sanyo公司，体式镜、倒置荧光显微镜和显微注射仪购自于日本Nikon公司。

1.3方法

1.3.1 卵母细胞的收集、培养和观察采用脊椎脱臼法处死小鼠，75%乙醇消毒腹部，眼科剪剪开皮肤，摘取两侧卵巢放入 M2 液滴中，捡取 GV 期裸卵。将捡取的 GV 期裸卵移入M2 液滴中，覆盖石蜡油，放入 5% CO2、 37 ℃、饱和湿度的培养箱中进行培养。小鼠卵母细胞一般在培养 3 h 进入 生发泡破裂(germinal vesicle breakdown，GVBD)期，9 h 进入第一次减数分裂中期(metaphase I ，MI期)，14～16 h 排出第一极体进入第二次减数分裂中期(metaphase II，MII期)。一般认为，生发泡破裂的发生和第一极体的排出是卵母细胞核成熟的标志。卵母细胞培养 3 h 和16 h后将培养皿取出置于倒置显微镜下观察并统计 GVBD 率和PBE 率。每组实验至少重复3次，每组至少观察20个卵母细胞。

1.3.2H2O2处理将收集的GV期卵母细胞放置于添加了不同浓度H2O2的M2培养基中进行不同时长的处理：0、25、50 μmol/L H2O2处理1 h，50、75、100 μmol/L H2O2处理1.5 h。处理结束后，用M2培养基清洗3次，再放置于M2 液滴中进行培养和后续观察。因50 μmol/L H2O2体外处理1.5 h的模式可以在明显抑制卵母细胞成熟的同时也不影响其存活能力，所以选择该组为H2O2处理组进行后续实验。

1.3.3SCFAs处理将50 μmol/L H2O2体外处理1.5 h后的卵母细胞用M2培养基清洗3次后，移入添加了SCFAs的M2液滴中进行培养和后续观察。其中，乙酸在体内的外周浓度为20～300 μmol/L，由1 mol/L的浓储液在M2培养基中稀释至终浓度为0.1、1和10 mmol/L；丙酸在体内的外周浓度为1～10 μmol/L，故由1 mol/L的浓储液在M2培养基中稀释至终浓度为1、10和100 μmol/L，丁酸在体内的外周浓度为0.2～4 μmol/L，故由1 mol/L的浓储液在M2培养基中稀释至终浓度为0.2、2和20 μmol/L。因1 mmol/L乙酸、10 μmol/L丙酸和2 μmol/L丁酸效果较好，所以选择这3组分别为H2O2+乙酸组、H2O2+丙酸组和H2O2+丁酸组进行后续实验。

1.3.4Western blot检测相关蛋白表达用0.2 mL EP管取10 μL稀释液(95 μL laemmil sample buffer+5 μL 2-Mercaptoethanol)，然后将每组的卵母细胞用口吸管移到EP管中，每组卵母细胞个数相同且>60个，100 ℃水浴10 min。配制10%SDS-PAGE 凝胶电泳，80 V恒压进行电泳，待溴酚蓝到达胶的底部时，关闭电泳，切割适当大小的凝胶至PVDF 膜上，275 mA 转膜90 min，将膜取出，放置于5%脱脂奶粉中室温封闭1 h，按比例稀释一抗(Akt 1∶1000、p-Akt 1∶1000)4 ℃冰箱过夜,第2天在室温下用TBST 洗膜3次，用对应二抗(山羊抗兔1∶1000)室温孵育1 h，TBST洗膜后3次后曝光、显影、定量。采用ImageJ进行灰度值和测定分析,计算各组蛋白的比值。每组实验重复3次。

1.3.5免疫荧光取各组MI、MII期卵母细胞于4% 多聚甲醛室温固定30 min，0.5% TritonX-100 溶液透膜 20 min，1% BSA (20 mL Wash +0.2g BSA)洗3次，3～5 min/次，1% BSA 室温封闭1 h，一抗(α-tubulin 1∶200)4 ℃孵育过夜(1%BSA稀释)，次日Wash溶液(100 mL PBS + 100 μL Tween-20 + 200 μL 5% TritonX-100)洗3遍，3～5 min/次，室温染核(Hoechst 1∶500，Wash溶液稀释)15 min，Wash溶液洗3次，封固，显微镜下观察。

2 结 果

2.1 SCFAs对H2O2诱导的卵母细胞的成熟率的影响卵母细胞成熟率结果显示，与对照组相比，H2O2处理组成熟率明显降低(P<0.01)，见图1；而与H2O2处理组相比，H2O2+乙酸组，H2O2+丙酸组和H2O2+丁酸组卵母细胞的成熟率显著上升(P<0.01)，见表1。

表 1 不同SCFAs对H2O2诱导的卵母细胞的体外成熟率的影响

图 1 不同SCFAs对H2O2诱导的卵母细胞的体外成熟的影响

2.2SCFAs对H2O2诱导的卵母细胞减数分裂的超微结构的影响免疫荧光结果显示，与对照组相比，H2O2处理组卵母细胞减数分裂时期染色体排列和纺锤体形态的异常率明显增多，H2O2+乙酸组、H2O2+丙酸组和H2O2+丁酸组明显改善，见图2。

2.3SCFAs对H2O2诱导的卵母细胞中Pi3k-Akt通路的影响Western blot结果显示，H2O2处理组p-Akt和Akt蛋白表达量的比值较对照组显著升高(P<0.01)，而H2O2+乙酸和H2O2+丙酸组较H2O2处理组明显降低(P<0.01)，见图3。

图 2 镜下观察SCFAs对H2O2诱导的卵母细胞减数分裂的超微结构的影响(免疫荧光染色 ×400)

1、5、9：对照组; 2、6、10：分别为乙酸组、丙酸组、丁酸组； 3、7、11：H2O2处理组； 4、8、12：H2O2+丁酸组

3 讨 论

氧化还原的平衡影响了生殖过程中的许多环节，例如，体内ROS增加使得卵母细胞中线粒体的功能缺陷[8]，年龄相关的卵巢老化与线粒体功能障碍和ROS聚集相关[9]。体内ROS积累还有许多其他原因，包括超重和不健康的生活方式[10]。由肠道微生物群通过发酵产生的SCFAs已在许多不同类型的细胞中被证明可以缓解由氧化和线粒体应激造成的损害[11]，并且在高龄雄性小鼠和雌性小鼠中都发现了SCFAs的减少[12-13]。本研究结果显示，H2O2处理后的小鼠卵母细胞的体外成熟明显受损，主要体现在GVBD率和PBE率的下降，而在添加了SCFAs后，卵母细胞的成熟率得到了改善。因体内的氧化应激是长期ROS累积产生的，涉及多种自由基的共同作用[14]，本研究在体外培养时受到时间因素的限制，只能选用显著高于体内生理浓度的H2O2浓度来尽量模拟体内的氧化应激状态。而SCFAs的起效浓度虽与体内有差异，但可为未成熟卵子体外成熟培养提供理论依据。未来将通过动物在体实验对SCFAs改善卵母细胞成熟进行进一步的体内研究探索。

过多的ROS导致的氧化应激是影响卵母细胞不良结局的重要因素[15]，ROS通过DNA损伤、线粒体改变、脂质过氧化及蛋白氧化修饰等影响未成熟卵母细胞的胞核与胞浆成熟,从而降低后续胚胎发育潜能[16]。在本研究中，我们发现3种不同的SCFAs都可以明显改善H2O2处理后卵母细胞减数分裂时期的染色体排列紊乱和纺锤体形态异常，便于后续获得继续减数分裂、成熟、受精及早期胚胎发育的能力。

在氧化应激的过程中，有多种信号通路的传导起着重要的作用，例如MAPK通路[17]、Pi3k/Akt通路、NF-κB通路[18]。其中，Pi3k/Akt通路在卵母细胞ROS增多后被激活，导致Akt被磷酸化活化，进一步增加ROS的产生，从而形成正反馈的恶性循环[19]。与此同时，有文献报道，SCFAs可以通过抑制Pi3k/Akt通路来影响胰岛素介导的脂肪蓄积[20]。因此，我们猜想Pi3k/Akt信号通路在SCFAs改善受到氧化应激的卵母细胞的发育成熟中起着重要的作用。在本研究中，我们发现H2O2预处理后会激活Pi3k/Akt通路，使p-Akt蛋白表达增加，而SCFAs干预后，这种现象被明显的抑制。其中乙酸和丙酸效果较好，而丁酸对H2O2处理的卵母细胞的Pi3k/Akt通路并没有明显的改善，说明可能有其他的通路调控着丁酸对H2O2处理的卵母细胞发育的影响。丁酸可以通过多种途径参与细胞功能的调节，例如，丁酸作为组蛋白去乙酰化酶3的抑制剂，可以通过调节肠道稳态来缓解炎症性肠病[21]，值得我们后期继续深入研究。

综上，本研究发现SCFAs能够改善氧化应激诱导的卵母细胞体外成熟障碍，恢复卵母细胞减数分裂时期染色体排列和纺锤体形态的异常，其可能是通过抑制Pi3k/Akt信号通路的表达进而改善卵母细胞的体外成熟，本研究为进一步探讨SCFAs在改善氧化应激卵母细胞的体外成熟奠定基础，对女性生殖的临床研究提供新的方法和理论依据。