LncRNA H19和VEGF-b在糖尿病视网膜病变患者中的表达及临床意义

唐晓蕾，代 艳，丁 倩，李 倩，蒋 艳，李 建

(1.绵阳市中心医院 眼科，四川 绵阳621000；2.巴中市通江县医院 眼科，四川 巴中635700)

糖尿病视网膜病变(DR)是糖尿病患者最常见的微血管并发症之一，已成为全球重要的公共卫生和经济问题[1]。其发病机制复杂，至今尚不明确。有研究表明，新血管形成可引起视网膜静脉阻塞和糖尿病性视网膜病等多种病理过程[3]。VEGF-b属于血管内皮生长因子家族成员，在病理组织中的蓄积会损害胰岛素信号传导，导致胰岛素抵抗和代谢功能障碍，并导致2型糖尿病[4]。VEGF-b通过控制内皮脂肪酸转运蛋白的表达来调节脂质通过血管内皮运输到组织细胞的过程，即下调该途径调节内皮细胞长链脂肪酸的摄取，引起脉络膜和视网膜新血管的形成，很多研究认为该作用可能与糖尿病性视网膜病变具有相关性[5-6]，但具体机制仍需要明确。长链非编码 RNA(LncRNA)在基因转录和蛋白质降解的直接调节以及细胞器生物发生和亚细胞运输等功能中具有重要作用[7]。研究表明，LncRNA与糖尿病等其他疾病的发生发展有关[8]，Thomas AA等研究表明LncRNA H19可通过Smad非依赖性机制涉及TGF-β调节糖尿病视网膜病变中的内皮-间质转化[9]。本研究探究了LncRNA H19和VEGF-b在糖尿病视网膜病变患者玻璃体和血清中的表达水平，并分析了这两个因子是否为糖尿病视网膜病变的危险因子，结果如下。

1 对象与方法

1.1 研究对象

选取于2017年5月-2019年6月期间就诊于绵阳市中心医院的2型糖尿病患者120例为研究对象，2型糖尿病诊断标准参考中国2型糖尿病防治指南(2010 版)[10]和2014年我国糖尿病视网膜病变临床诊疗指南[11]，根据眼底镜和眼底荧光血管造影检查结果将研究对象分为糖尿病无视网膜病变组(DM组，男19例，女21例)、非增殖型糖尿病视网膜病变组(NPDR组，男20例，女20例)和增殖型糖尿病视网膜病变组(PDR组，男20例，女20例)3组，每组各40例患者(40眼)。另选特发性黄斑裂孔且不伴糖尿病的患者40例(40眼)做对照组(NC组)，四组患者在年龄和性别方面差异无统计学意义(P>0.05)，DM组、NPDR组和PDR组患者在糖尿病病程、空腹血糖水平及糖化血红蛋白水平等方面差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。本次研究征得医院医学伦理学会同意，所有患者均签署知情同意书。排除标准：有既往眼部手术患者(除NC组除外)；患有慢性疾病患者；患有肿瘤及免疫系统疾病者；近期患有眼部感染患者。

表1 4组患者基本信息比较

1.2 样品采集与存储

用临床上常用的含抗凝剂的采血管空腹采集所有受试者血液样本5 ml，将血液放置在室温下凝结30 min后，3 000 rpm离心10 min取血清，立即将其冷冻在-80℃冰箱中备用；玻璃体样品采集方法参考之前报道[12]，于玻璃体切除术时收集所有受试者玻璃体液和增生膜组织。于灌注前用玻璃体切割头收集玻璃体液0.4 ml,于4-6℃保存备用。术中收集 PDR患眼视网膜前增生膜和对照组内界膜组织,于-80℃保存备用。检测LncRNA H19的玻璃体样品盛放装置需提前用RNA酶处理，以便保证RNA的提取质量。

1.3 ELISA试剂盒检测玻璃体和血清中VEGF-b、IL-6、TNF-α的检测

利用ELISA试剂盒检测玻璃体和血清中VEGF-b、IL-6、TNF-α水平(ELISA试剂盒均购自上海酶联生物科技有限公司)，检测方法按产品说明书进行。

1.4 RT-qPCR检测患者玻璃体和血清中LncRNA H19的表达水平

空腹采集所有受试者血液样本10 ml，使血液在室温下凝结30 min后，3 000 rpm离心10 min取血清，立即将其冷冻在80℃冰箱待检。用总RNA提取试剂盒(赛默飞世尔科技(中国)有限公司)提取血清中的总RNA，检测吸光度值(OD)，若OD260/OD280在1.8-2.0之间则提取符合要求。将总RNA利用反转录试剂盒(赛默飞世尔科技(中国)有限公司)反转录合成cDNA，以cDNA为模板进行扩增，用2-ΔΔCT表示受试者玻璃体和血清中LncRNA H19的相对表达水平。

1.5 免疫组化检测LncRNA H19和VEGF-b阳性表达

将PDR组和NC组患者膜组织标本进行常规脱蜡及水化，把组织浸入二甲苯溶液中处理三次，完成后，再分别浸入不同浓度的酒精中。在由100 ml 0.01 mol枸橼酸缓冲液+3 ml H2O+10 μl曲拉通X-100冲洗、浸泡，PBS冲洗3次，每次3 min；完成后，放入95°水浴加热修复15 min，冷却至室温。冲洗，室温封闭，滴加一抗，37℃ 30-40 min，冲洗，滴加二抗，37℃ 40 min，冲洗，DAB显色，水洗终止反应，苏木素复染，分化，梯度酒精脱水干燥，中性树胶封固，阳性染色为棕黄色，采用Motic高清晰彩色图像测量系统分析。

1.6 Western blotting检测VEGF-b、IL-6、TNF-α蛋白表达

用蛋白提取试剂盒提取视网膜组织全蛋白后，经电泳和转膜后，用5%脱脂奶粉封闭2 h，4℃孵育过夜后PBS缓冲液15 min/3次洗膜后再用二抗室温下孵育2 h，加入显色剂曝光后，通过Image-Pro Plus系统分析蛋白条带灰度值，β-actin作为内参蛋白。

1.7 统计学分析

2 结果

2.1 LncRNA H19和VEGF-b阳性表达

NC组患者视网膜组织中LncRNA H19阳性表达数高于PDR组(P<0.05)，VEGF-b阳性表达数低于PDR组(P<0.05)，见图1。

图1 NC组和PDR组患者LncRNA H19阳性表达结果比较

2.2 4组受试者玻璃体和血清中VEGF-b、IL-6、TNF-α表达水平比较

采用ELISA方法检测4组受试者玻璃体和血清中VEGF-b、IL-6、TNF-α表达水平，结果表明与NC组相比，DM组、NPDR组和PDR组三组受试者中随着视网膜病变的发生以及病程的延长，玻璃体和血清中VEGF-b和IL-6水平逐渐升高，差异有统计学意义(P<0.05)，VEGF-b在玻璃体和血清中的表达具有一致性。此外，VEGF-b检测结果与免疫组化结果也具有一致性；TNF-α在四组受试者玻璃体和血清中水平相似，差异无统计学意义，如表2所示。

表2 各组受试者血清中VEGF-b、IL-6、TNF-α水平比较

2.3 4组受试者玻璃体和血清中LncRNA H19相对表达水平比较

4组受试者玻璃体和血清中LncRNA H19相对表达水平如图2所示，结果表明NC组受试者LncRNA H19相对表达水平最高，DM组水平次之，PDR组LncRNA H19表达水平最低，玻璃体和血清中LncRNA H19相对表达水平趋势相同，结果具有一致性，由此可知随着视网膜的病变LncRNA H19表达水平也会降低。

图2 4组受试者玻璃体和血清中LncRNA H19相对表达水平比较

2.4 Western blotting检测PDR组和NC组患者膜组织中VEGF-b、IL-6、TNF-α蛋白表达

PDR组患者膜组织中VEGF-b、IL-6蛋白表达水平显著高于NC组(P<0.05)，2组TNF-α无显著差异，这与免疫组化和ELISA检测结果一致，如图3所示。

图3 PDR组和NC组患者膜组织中VEGF-b、IL-6、TNF-α蛋白表达水平

2.5 PDR组患者血清中VEGF-b、LncRNA H19与IL-6、TNF-α相关性分析

Pearson 相关性分析结果提示血清中VEGF-b浓度与血清中IL-6水平呈线性正相关(r=0.899，P<0.01)，见图(4A)；而血清中LncRNA H19相对表达水平与血清中IL-6浓度呈线性负相关(r=-0.858,P<0.01)，见图(4B)。而血清中VEGF-b和LncRNA H19水平与血清中TNF-α浓度无明显相关关系，相关性结果分别为(r=0.316,P=0.417)(r=-0.146，P=0.649)。

2.6 采用Logistic多元回归分析VEGF-b和LncRNA H19是否为糖尿病视网膜病变的危险因素

已有无糖尿病视网膜病变为因变量，以VEGF-b、LncRNA H19、病程、家族史、肥胖(IBM≥25 kg/m2)、高龄(≥60岁)、高血脂、饮酒、吸烟为自变量，行Logistic多元回归分析，结果表明VEGF-b、LncRNA H19、病程为糖尿病视网膜病变的危险因素，见表3。

表3 Logistic多元回归分析糖尿病视网膜病变危险因素

3 讨论

糖尿病性视网膜病变是最常见且最严重的眼部并发症[12]。在2.46亿的糖尿病患者中，约有1/3患有糖尿病性视网膜病的迹象，其中1/3可能患有视力威胁性视网膜病，即严重的视网膜病或黄斑水肿。另外糖尿病视网膜病变的存在还意味着增加患者全身性血管并发症的风险[13]。因此早期预防和治疗糖尿病性视网膜病变意义重大。本研究发现NC组患者视网膜组织中LncRNA H19阳性表达数高于PDR组，而VEGF-b阳性表达数低于PDR组，LncRNA H19或VEGF-b在玻璃体和血清中的表达结果也具有一致性，提示LncRNA H19和VEGF-b可能在糖尿病性视网膜病变中发挥了重要作用，但仍需要进一步明确。

图4 PDR组患者血清中VEGF-b与IL-6相关性分析结果(A),PDR组患者血清中LncRNA H19相对表达量与IL-6水平相关性分析结果(B)

IL-6是一种细胞炎性因子，在整个炎症过程中均起作用，并可能导致血管通透性增加,在胰岛素抵抗过程中也发挥着重要作用[14]，很多研究证实其在视网膜病变患者体内水平的增加可能参与了病变的发生发展[15]。本研究结果表明，在DM组、NPDR组和PDR组患者玻璃体和血清中中IL-6水平升高，结果具有一致性，且在PDR患者视网膜组织中IL-6蛋白表达升高，差异有统计学意义，证实IL-6可能参与了糖尿病视网膜病变的发生发展。

本研究通过相关性分析表明PDR患者血清中VEGF-b表达水平与血清中IL-6水平具有正相关关系，而糖尿病无视网膜病变患者玻璃体和血清中VEGF-b表达水平比对照组表达水平升高，且单纯型糖尿病视网膜病变组和增殖型糖尿病视网膜病变组患者玻璃体和血清中VEGF-b表达水平更高，提示VEGF-b可能与IL-6一样参与了糖尿病视网膜病变过程。VEGF-b是VEGF同源物，其在体内可以靶向抑制脉络膜和视网膜新血管形成。从机理上讲，VEGF-b的血管存活作用是通过调节许多经由NP-1和VEGFR-1的血管存活基因的表达来实现的[16]。有研究表明，VEGF-b在血管系统中的功能起着“生存”的作用，而不是“血管生成”因子，因此VEGF-b的抑制作用可能为治疗新血管疾病提供新的治疗机会[17]。另外本研究检测膜组织中VEGF-b蛋白表达发现，PDR组患者膜组织中VEGF-b蛋白表达水平显著高于NC组，这与免疫组化和ELISA检测结果一致，本研究还发现,VEGF-b是糖尿病视网膜病变的危险因素，推测 VEGF-b可能参与了糖尿病视网膜病变的发生发展，通过抑制视网膜病变患者血清中的VEGF-b水平可能会降低患者病变程度。

在糖尿病中，高糖水平的暴露会降低新生心肌细胞以及链脲佐菌素(STZ)诱导的糖尿病大鼠心肌中LncRNA H19的表达，该模型被用作糖尿病模型，研究结果表明LncRNA H19在糖尿病大鼠心肌中表达水平显著下调，这可能与心肌细胞自噬增加和心脏功能受损有关[18]。本研究结果表明NC组LncRNA H19相对表达水平最高，糖尿病无视网膜病变组水平次之，增殖型糖尿病视网膜病变组LncRNA H19表达水平最低，由此可知随着视网膜病变的发展LncRNA H19表达水平也会降低，说明LncRNA H19可能与糖尿病视网膜病变有关。此外，相关性分析表明，PDR患者血清中LncRNA H19相对表达水平与IL-6浓度具有负相关关系，Logistic多元回归分析显示LncRNA H19是糖尿病视网膜病变的危险因素，因此其水平的降低可能参与了糖尿病视网膜病变的发生和发展。

综上所述，糖尿病视网膜病变患者玻璃体和血清中VEGF-b水平升高、LncRNA H19水平降低，两者均为糖尿病视网膜病变的危险因素，可能与病变的发生发展相关，有望为糖尿病视网膜病变的发病机制提供新方向。