青花菜SKIP基因的克隆与表达分析

韦海忠，潘丽芹，汤紫依，田盛野，何海叶，尹龙飞，郑德伟，张慧娟，蒋 明，*

(1.台州科技职业学院，浙江 台州 318020； 2.台州学院 生命科学学院，浙江 台州 318000)

青花菜(var.)又名西兰花、绿花菜和木立花椰菜等，为十字花科(Cruciferae)芸薹属一、二年生蔬菜作物，它是甘蓝的一个变种，以花茎和花蕾群为主要食用部位，可用于生吃或熟食，味道鲜美、营养丰富，加之具有一定的抗癌作用，深受消费者的欢迎。青花菜于19世纪80年代引入浙江、云南、福建等省，虽然在我国的栽培历史较短，但栽培面积增加迅速，目前已成为世界青花菜的主产国之一，预计2025—2035年我国的青花菜栽植面积将达到16.7～20.0万hm。随着栽培范围的不断扩大，青花菜病害发生也有逐渐加重的趋势，霜霉病和黑腐病是十字花科蔬菜栽培过程中的常见病害，它们分别由寄生霜霉菌()和野油菜黄单胞菌(pv.)引起。寄生霜霉菌与野油菜黄单胞菌分别为活体寄生菌(biotroph)和半活体寄生菌(hemibiotroph)，它们的寄主范围广，危害作物种类多，对十字花科蔬菜生产的影响尤为严重。通过多年的调查发现，霜霉病和黑腐病在青花菜的整个生育期均可发生，侵染子叶、叶片和花蕾等，影响植株的生长发育、产量和品质。

除生物胁迫外，非生物胁迫对蔬菜生产的影响也十分巨大，干旱和盐害是两种较为常见的非生物逆境，它们也是青花菜的重要产量限制因子；青花菜虽然有一定的耐盐性，但土壤盐度过高，也会造成植株生长不良，并最终影响花球产量和品质。我国不是青花菜的原产地，种质资源稀缺，抗逆种质更为匮乏，通过挖掘功能基因进行分子育种是培育抗逆新材料的重要途径。SKIP(SKI-interacting protein)是一种十分保守的蛋白质，存在于酵母、真菌、动物和植物等真核生物中，参与转录调控和RNA剪接。在酵母中，SKIP参与细胞生长和分裂，在动物中则与器官发生、神经发育和胚胎生长相关。SKIP在植物中的功能较多，涉及生长、发育和逆境防御等过程。拟南芥()SKIP参与脱落酸(abscisic acid，ABA)信号途径，与植物盐胁迫和渗透压胁迫的耐受性相关；它与剪接因子(splicing factor)互作，参与生物钟的调控；SKIP还与成花转变(floral transition)和开花时间的调控有关。最近，有研究表明，SKIP参与番茄()的抗病反应。植物SKIP的文献不多，而在青花菜中的研究未见报道。本研究以青花菜为材料，在克隆基因的基础上，明确其在生物胁迫和非生物胁迫下的表达模式，为研究该基因在逆境响应中的功能奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

青花菜株系Bo0202栽植于人工气候箱，四叶一心期用喷雾法接种病原菌。寄生霜霉菌的孢子浓度为1×10mL，野油菜黄单胞菌的孢子浓度为1×10mL，对照喷洒等量的无菌水。收集喷雾0、24、48、72、96 h的叶片，用于RNA和DNA的提取。四叶一心期的植株用于盐胁迫和干旱胁迫，盐胁迫采用150 mmol·L的NaCl，PEG6000用于干旱模拟，工作浓度为20%。采集胁迫处理0、12、24、48、72 h的叶片，用于RNA的提取。

从NCBI下载BoiSKIP的同源蛋白质序列，它们分别来自甘蓝型油菜(，登录号：XP_013688403)、萝卜(，登录号：XP_018456548)、(登录号：CAA7013451)、(登录号：KAF2606023)、拟南芥(， 登录号：OAP19162)、芜菁(，登录号：RID56290)、荠菜(，登录号：XP_006301006)、山嵛菜(，登录号：XP_006390116)、亚麻荠(，登录号：XP_010471904)、甘蓝(var.，登录号：XP_013591577)、琴叶拟南芥(subsp.，登录号：XP_020890221)和黄瓜(，登录号：XP_031736674)等，其中的黄瓜SKIP作为系统发育树的外类群。

1.2 DNA、RNA提取和cDNA的合成

基因组DNA的提取采用试剂盒法，新型植物基因组DNA快速提取试剂盒购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司(鼎国公司)，实验按照其提供的说明书进行；RNA的提取采用TRIzol法，试剂购自Invitrogen，操作根据说明书进行；cDNA合成试剂盒购自TaKaRa公司，按说明书进行实验操作。DNA和RNA经电泳检测与浓度测定，置于-80 ℃冰箱备用。

1.3 BoiSKIP基因的克隆

用于克隆基因的上游、下游引物分别为SKIP1：5′-ATGGCGTCTCTTAAGGACCGTCTA-3′和SKIP2：5′-TTAACGATCACCACGTTCGAAATTG-3′。PCR反应在伯乐S1000上进行，分别加入2 μL 10×PCR缓冲液、0.5 U的DNA聚合酶(北京鼎国生物技术有限责任公司)、0.6 μL 10 mmol·L的dNTPs[生工生物工程(上海)股份有限公司]、上游和下游引物各0.3 μL(20 μmol·L)、25 ng模板DNA或cDNA，加ddHO至20 μL。PCR反应程序为：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，56.3 ℃退火45 s，72 ℃延伸120 s，共32个循环；72 ℃延伸10 min。PCR产物经电泳检测，利用DNA凝胶回收试剂盒(碧云天生物技术研究所)回收胶块上的目的基因。连接采用pGEM-T easy载体(Promega)，在4 ℃反应过夜，42 ℃热激90 s将连接产物导入DH5α感受态细胞。经涂布、挑取单菌落和菌液PCR检测，各挑3份阳性菌液用于测序。

1.4 生物信息学分析

采用ProtParam在线工具(http://web.expasy.org/protparam)预测蛋白质的分子量、等电点、原子组成、不稳定系数和平均亲水性系数等；利用ProtScale(http://web.expasy.org/protscale)绘制亲疏水性图谱；借助SMART在线工具(http://smart.embl-heidelberg.de)预测BoiSKIP的结构域；Mega 3.1用于生成系统发育树，建树方法为邻接法(Neighbor-Joining，NJ)，bootstrap值设为1 000。

1.5 基因表达分析

根据测序结果，设计1对引物用于表达分析，引物名称和序列分别为SKIP3：5′-GGCGGCGAAGTTATGTACGAT-3′和SKIP4：5′-GTGCTGTGAACAAGCCTTTGTC-3′。内标为肌动蛋白基因，上游和下游引物的名称与序列分别为ACTUP：5′-TCTCGATGGAAGAGCTGGTT-3′和ACTDN：5′-GATCCTTACCGAGGGAGGTT-3′。PCR反应在LightCycler96实时定量PCR仪上进行，依次加入10 μL 2×Master Mix、上游/下游引物各0.2 μL(20 μmol·L)、25 ng cDNA，最后加ddHO至20 μL；反应程序为：95 ℃预变性10 min；95 ℃变性15 s，55 ℃退火15 s，72 ℃延伸30 s，共40个循环。实验重复3次，用2法计算基因的相对表达量。

2 结果与分析

2.1 BoiSKIP基因的特征

利用PCR方法克隆了基因的DNA和cDNA序列，测序结果表明，该基因的全长为1 836 bp，没有内含子；编码611个氨基酸；Smart在线工具预测结果表明，BoiSKIP具1个SNW/SKI结构域，位于氨基酸序列的188-347处(图1)；BoiSKIP的分子量为69.22 ku，理论等电点为9.15，平均亲水性指数为-1.12，由于该值为负数，因此BoiSKIP为亲水性蛋白(图2)；蛋白质的不稳定系数为45.89，大于40，所以BoiSKIP是一种不稳定蛋白；BoiSKIP的原子总数为9 661，分子式为CHNOS。

高亮部分为SNW/SKI结构域。

图2 BoiSKIP的亲水性/疏水性预测

2.2 系统发育分析

从NCBI下载了12条SKIP同源蛋白序列，其中11条来自十字花科植物，另一条来自黄瓜。利用Mega软件对蛋白质序列进行多重比对，结果表明，SKIP序列之间的相似性较高，仅个别氨基酸残基存在差异。13条SKIP序列之间的平均遗传距离为0.100，拟南芥与黄瓜SKIP之间的遗传距离最大，为0.255；青花菜BoiSKIP与甘蓝SKIP之间的遗传距离最小，仅为0.002。SNW/SKI序列的保守性更高，青花菜、甘蓝型油菜和甘蓝的SNW/SKI序列完全相同，与荠菜SNK/SKI结构域仅有2个氨基酸残基不同(图3)。

XP_013688403，甘蓝型油菜；XP_018456548，萝卜；CAA7013451，Microthlaspi erraticum;KAF2606023，Brassica cretica；OAP19162，拟南芥；RID56290，芜菁；XP_006301006，荠菜；XP_006390116，山嵛菜；XP_010471904，亚麻荠；XP_013591577，甘蓝；XP_020890221，琴叶拟南芥；XP_031736674，黄瓜。

系统发育分析结果表明，5种芸薹属植物的SKIP聚为一组，支持率达100%，其中BoSKIP与甘蓝SKIP处于同一分支，而芜菁和甘蓝型油菜处于另一条分支。两种拟南芥属植物聚于组V，支持率达98%，而萝卜、荠菜、亚麻荠、山嵛菜和黄瓜等各自单独成组(图4)。

图4 青花菜BoiSKIP及其同源序列的系统发育树

2.3 BoiSKIP基因在胁迫下的表达

利用实时荧光定量PCR研究基因在非生物胁迫下的表达，结果表明，NaCl和PEG6000均可诱导该基因的表达，随着胁迫时间的延长，表达量的变化均先上升后下降(图5)。在NaCl处理24 h的表达量最高，为对照的5.92倍，12 h和48 h的表达量显著高于0 h，而72 h的表达量与0 h没有显著差异。经PEG6000处理，基因在12 h达到最大值，为对照的4.2倍，24 h的表达量为对照的2.3倍，而48 h和72 h的表达量与0 h没有显著差异。

图5 BoiSKIP基因在非生物胁迫下的表达

寄生霜霉菌和野油菜黄单胞菌均可诱导的表达，但表达模式存在差异。在2种病原菌的诱导下，基因的表达量均呈先上升后下降的规律。在寄生霜霉菌诱导下，24～96 h的表达量均显著高于0 h，其中，24 h的表达量最高，为0 h的2.01倍，48 h的表达量次之，为0 h的1.29倍；用野油菜黄单胞菌处理，24～72 h的表达量显著高于0 h，72 h的表达量最高，为0 h的2.43倍，而96 h的表达量与0 h没有显著差异(图6)。

A，寄生霜霉菌处理；B，野油菜黄单胞菌处理。

3 讨论

SKIP最早在黑腹果蝇()中发现，该蛋白被命名为BX42，它是泡状(Puff)染色体特异蛋白，其编码区全长为1 641 bp，编码547个氨基酸，该基因在染色质调控中起着重要作用。人()SKIP与BX42同源，由536个氨基酸组成，序列与BX42的相似性超过60%，后被证实SKIP为癌蛋白Ski的结合蛋白。拟南芥只有一个SKIP成员，该基因没有内含子，编码区全长为1 842 bp，编码613个氨基酸，分子量为67.5 ku。水稻()有2个SKIP成员，分别命名为和，它们与人SKIP的相似性分别为49%和46%，其中，编码607个氨基酸，它的190-356位为SNW/SKI结构域。玉米()SKIP基因的编码区全长为1 830 bp，没有检测到内含子，该基因编码609个氨基酸，SNW/SKI结构域位于188-347残基处。本研究中，青花菜的编码区全长为1 836 bp，序列长于玉米和水稻的，但短于拟南芥的；目前已知的基因均无内含子，本研究克隆的中也没有内含子。SKIP是一个保守蛋白，BoiSKIP与十字花科SKIP同源蛋白质的相似性较高，仅个别氨基酸残基存在差异，而结构域SNW/SKI序列的保守性更高，暗示这些蛋白质可能具有类似的功能。

植物SKIP参与逆境胁迫的响应，在抵御不良环境方面有着重要作用。拟南芥经NaCl、脱落酸和甘露醇处理后，的表达量显著提高，其过量表达提高了植物对这些逆境的抗性。水稻的抑制表达导致植株生长停滞和细胞活力下降，而过量表达则可显著提高其对ABA、盐、甘露醇和干旱的抗性。玉米的表达受干旱、ABA和NaCl的诱导，最大表达量分别为对照的7.0、3.6和8.6倍，该基因的过量表达可显著增加烟草()对干旱、ABA和NaCl的耐受能力。本研究中，的表达受NaCl和PEG6000的诱导，推测该基因与青花菜耐盐和抗旱相关。基因在生物胁迫中的功能也有研究，番茄1的表达受丁香假单胞菌番茄致病变种(pv.)DC3000和灰霉菌()的诱导，最高表达量分别为对照的6.3倍与7.1倍，而1的表达并不受这两种病原菌的诱导，利用病毒诱导基因沉默(virus-induced gene silencing，VIGS)抑制1的表达，发现番茄对DC3000和灰霉菌的抗性减弱。青花菜的表达受寄生霜霉菌和野油菜黄单胞菌的诱导，表达量呈先上升后下降的趋势，推测该基因可能与霜霉病和黑腐病抗性有关。

4 结论

本研究以青花菜为材料，在克隆基因的基础上，进行了序列分析、系统发育分析和表达分析。基因的全长为1 836 bp，编码611个氨基酸，具1个SNW/SKI结构域；BoiSKIP的分子量与理论等电点分别为69.22 ku和9.15。芸薹属植物的SKIP在系统发育树上聚为一组，支持率达100%。的表达受NaCl和PEG6000的诱导，也受生物因素寄生霜霉菌和野油菜黄单胞菌的诱导。