大豆异黄酮干预肥胖大鼠肝氧化应激及炎症反应

熊昕宜，许泽玉，何念佳，何俊博，陈正礼，黄 超，刘文涛，罗启慧

(四川农业大学 动物医学院， 动物疾病模型实验室， 四川 成都 611130)

肥胖症(obesity)是机体内脂肪堆积过多体重超常的一种慢性疾病。脂肪堆积所造成的组织功能障碍会导致许多代谢综合征，包括Ⅱ型糖尿病，非酒精性脂肪肝疾病(NAFLD)和心血管疾病等等。目前全球超重和肥胖人数已达21亿，可以说肥胖已成为全球亟需解决的公共卫生问题。肝脏作为体内重要的新陈代谢的器官，脂质的过量沉积会导致肝细胞发生氧化应激、脂质过氧化和炎症反应等，引起肝脏细胞凋亡，从而导致肝功能紊乱。具体而言，肥胖一方面可通过损伤线粒体功能，导致活性氧(ROS)和直至过氧化的产生从而导致肝细胞的氧化应激。另一方面，高脂饮食所致的肥胖还会引起慢性低度无菌炎症或代谢组织炎症。而氧化应激与炎症反应是许多肝脏疾病的发病机理和关键因素。大豆异黄酮是一种从大豆中提取的天然化合物，主要存在于大豆胚轴中，在大豆生长过程中的次级代谢产生，具有雌激素活性，故又称植物激素。研究表明，大豆异黄酮有多种生理功能，其中包括抗氧化、广泛抗炎、降脂等作用。SIF的抗氧化作用主要表现在抑制氧自由基产生、抑制过氧化氢生成、减少DNA氧化损伤以及抑制脂质过氧化，此外SIF还可以提高机体超氧化物歧化酶的生物学功能等等。然而SIF对于肥胖情况下肝脏的氧化应激以及炎症反应的影响，尤其是不同剂量下的影响还鲜有报道。因此本试验旨在探讨不同剂量大豆异黄酮对肥胖大鼠肝脏氧化应激状态及炎症反应的干预，以期为大豆异黄酮的对肥胖的干预机制提供理论依据，同时为大豆异黄酮进一步的应用提供新思路。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 试验动物

5周龄健康SD雄性大鼠80只，购自四川省成都市达硕生物科技有限公司，使用许可证号：SCXK(川)2015-030。

1.1.2 试验物品及试剂

试验大鼠专用饲料和垫料，购自四川省成都市达硕生物有限公司；高脂日粮(基础饲料69.5%、猪油15%、蔗糖15%、猪胆盐 0.5%)，购自四川普莱美生物科技有限公司；大豆异黄酮，产品批号：NF-20170127，购自西安天丰生物有限公司，纯度为90%。SOD试剂盒、CAT试剂盒、GSH-Px试剂盒，购自南京建成科技有限公司；SYBR Premix ExTM Ⅱ(Tli RNaseH Plus)，购自宝生物技术(北京)公司；RNAprep pure动物组织总RNA提取试剂盒(DP431)，购自天根生化科技有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 动物模型建立和处理

80只大鼠随机分为普通组(=16)和肥胖组(=64)，分别饲喂基础饲料和高脂饲料9周，每周称量大鼠体重，每天观察记录大鼠体况。第9周末采血检测甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、高密度脂蛋白(HDL)和低密度脂蛋白(LDL)含量。若肥胖组大鼠体重超过普通组的20%，血脂含量明显高于普通组则肥胖模型建立成功。

建模成功后，将肥胖大鼠按剂量(0、150、300、450 mg·kg)SIF随机分为肥胖对照组(F组，=16)、低剂量组(L组，=16)、中剂量组(M组，=16)和高剂量组(H组，=16)，普通对照组(C组，=16)灌喂0.5%羧甲基纤维素钠2 mL·kg。SIF用0.5%羧甲基纤维素钠溶解。SIF灌喂4周，每周末称量体重。第13周末，禁食12 h后腹腔注射10%水合氯醛(4 mL·kg)麻醉，无菌采集肝脏组织，一部分于4%多聚甲醛中固定，一部分存放于-80 ℃保存备用。实验中对动物的处置符合《关于善待实验动物的指导性意见》。动物福利符合“美国国家卫生研究院实验室动物饲养管理和使用指南(The National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animal)的要求。本实验由四川农业大学伦理委员会批准。

1.2.2 肝脏组织病理学观察

将多聚甲醛中固定的肝脏组织样本流水冲洗过夜，梯度酒精脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，切片(4 μm)，进行苏木精-伊红染色(HE)，光镜观察组织学变化。

1.2.3 肝脏组织SOD、GSH-Px、CAT水平检测

准确称取组织质量(0.5±0.05)g，按照组织质量(g)与生理盐水体积(mL)质量体积比1∶9的比例加入9倍体积的生理盐水，剪碎组织块，冰水浴制备匀浆，2 500～3 000 r·min，离心10 min，取10%匀浆上清液待用。

根据试剂盒方法步骤检测各组大鼠肝脏组织中SOD、GSH-Px、CAT活性。

1.2.4 肝脏组织IL-6、IL-1β、TNF-α mRNA表达水平检测

取适量肝脏组织研磨成匀浆，用总RNA提取试剂盒提取肝脏组织RNA，收集RNA溶液。提取出的RNA可于-80 ℃保存。采用PCR仪将肝脏匀浆中提取出来的RNA溶液反转录出cDNA。采用荧光定量PCR仪扩增cDNA。反应条件：95 ℃预变性2 min；95 ℃变性5 s，65 ℃退火延伸30 s，40个循环；扩增循环结束后，降温至65 ℃，然后加热升温至95 ℃变性DNA产物。读取每个样本的C值，采用相对定量法，以-mRNA表达量为内参，用Bio-Rad CFX Manager 软件分析所得数据。各基因上下游引物参考自徐兆坤等。

1.3 统计学方法

利用SPSS 20.0 统计软件进行单因素方差分析(one-way ANOVA)，数据以平均值±标准差表示(±SD)，<0.05表示差异显著，<0.01表示差异极显著。

2 结果与分析

2.1 高脂肥胖及大豆异黄酮干预大鼠体重及血脂水平变化

饲喂高脂日粮4周后，两组大鼠体重呈现显著差异(<0.05)，此后差异愈加明显，到第9周时，高脂组大鼠体重极显著高于普通组(<0.01)，达到了超过20%体重的肥胖标准(图1-A)。第9周高脂日粮组大鼠血清中 TC、TG、LDL 水平均显著高于普通组(<0.05或<0.01)(图1-C)。可见，高脂日粮饲喂 9 周后，成功建立食源性肥胖大鼠模型。SIF干预4周后，各组大鼠体重持续增长，SIF干预前、后，高脂组大鼠体重增加最多，与SIF干预组相比差异显著(图1-B)。SIF干预期间，肥胖组血清中 TC、TG 和 LDL含量显著高于普通组，SIF干预高剂量组血清中TC和 LDL含量明显低于肥胖组(图1-D)。

TG，甘油三酯；TC，总胆固醇；HDL，高密度脂蛋白；LDL，低密度酯蛋白。*，**分别表示不同处理组间差异达显著(P<0.05)或极显著(P<0.01)水平。下同。

2.2 大豆异黄酮干预逆转肥胖致大鼠肝组织损伤

肝脏组织形态学结构观察发现，C组大鼠肝脏结构、肝细胞形态均未见异常病理变化(图2-A)。F组大鼠肝脏肝细胞呈现弥漫性重度脂肪变性伴炎性细胞浸润，肝细胞肿胀，肝索排列紊乱(图2-B)。L组大鼠肝脏病变较F组有轻微改善，但仍可见上述病变(图2-C)。M组大鼠肝脏病变明显改善，未见明显异常病理变化(图2-D)。H组小鼠肝脏可见局灶性肝细胞脂肪变性和肝索紊乱，但较F组和L组轻微(图2-E)。

A， 空白对照组；B，肥胖对照组；C，低剂量组；D，中剂量组；E，高剂量组。

2.3 大豆异黄酮干预改善了肥胖大鼠肝脏氧化应激

大豆异黄酮干预后，肝脏的抗氧化指标检测结果详见表1。与C组相比，F组肝脏SOD、CAT和GSH-Px水平显著降低(<0.05)。与F组相比，SIF各剂量组SOD、CAT和GSH-Px水平均显著升高，并呈现剂量依赖效应。可见，SIF干预改善了肥胖大鼠肝脏的氧化应激。

表1 大豆异黄酮干预改善了肥胖大鼠肝脏氧化应激

2.4 大豆异黄酮干预下调肥胖大鼠肝脏炎症反应

通过检测肝脏中IL-1β、IL-6和TNF-α的mRNA表达量发现，F组中IL-1β、IL-6 和TNF-α mRNA表达量均显著高于C组。不同剂量SIF干预后，各剂量组肝脏中IL-1β mRNA表达量不同程度的降低，高剂量组达到了显著水平；IL-6 mRNA表达量呈剂量依赖性降低，中剂量组和高剂量组达到显著水平；TNF-α mRNA在各剂量组的表达均显著下调，高剂量组恢复到C组水平(图3)。可见，SIF干预下调了肥胖大鼠肝脏的炎症反应。

图3 大豆异黄酮干预下调肥胖大鼠肝脏炎症反应

3 讨论

本实验结果表明，高脂饮食引起的肥胖导致大鼠肝脏组织病理学损伤，大豆异黄酮干预后各剂量组较肥胖对照组有明显改善，尤其在中剂量组水平更为明显，高剂量组的肝组织损伤恢复不如中剂量组。因此，适当剂量的大豆异黄酮对食源性肥胖大鼠的肝脏损伤干预是需要考虑并进一步研究的。

氧化应激(oxidative stress，OS)是指机体氧化与抗氧化系统失调，引起过量的活性氧类(reactive oxygen species，ROS)在机体内蓄积，从而导致分子、细胞、组织氧化损伤的病理过程，现有研究指出高脂饮食可导致氧化应激。SOD和CAT是体内重要的抗氧化酶，也是细胞抵御氧化损伤的第一道防线；GSH-Px是机体内广泛存在的一种重要的过氧化物分解酶。当氧化脂质的负担过大时，往往会导致抗氧化酶合成减少。本研究发现，肥胖组SOD、CAT和GSH-Px水平明显降低，由此推测是由于肝脏自由基的堆积所导致的抗氧化酶SOD和CAT的消耗。与此同时，当自由基大量增加时，CAT与GSH-Px 共同作用以降解大量堆积的过氧化氢和脂类过氧化物。二者的共同作用导致了肥胖组SOD、CAT和GSH-Px水平降低。而大豆异黄酮具有较强的还原性，且对小鼠肝脏的损伤与其抗氧化作用相关。本文发现大豆异黄酮干预后，大鼠肝脏SOD、CAT和GSH-Px水平升高，表明大豆异黄酮干预改善了肥胖大鼠肝脏的氧化应激。

肥胖可诱导一种全身性的慢性低度炎症反应，慢性炎症区别于传统炎症，并不出现“红、肿、热、痛”的症状，而是血液中促炎症因子含量明显增加，如 TNF-α、IL-1β、IL-6等。从本文的结果看，长期高脂饮食促发了大鼠肝脏炎症反应，使肝脏TNF-α、IL-1β、IL-6的mRNA表达水平升高，肥胖组大鼠肝脏细胞呈现不同程度的脂肪浸润和炎性浸润。已有研究结果表明，通过合理饮食、吸脂术等方式使脂肪含量降低时可使多种炎症因子含量降低。结合本研究中不同浓度大豆异黄酮干预后各炎症因子表达量不同程度下降的结果，推测肥胖导致促炎因子分泌增多，大豆异黄酮可通过减少促炎细胞因子的表达来降低高脂肥胖大鼠肝脏炎症。

综上所述，高脂饮食引起的肥胖会导致大鼠肝脏组织病理学损伤、氧化应激反应和炎症反应，大豆异黄酮可通过增强SOD、GSH-Px、CAT活力，抑制促炎症因子的表达，来逆转肥胖导致的大鼠肝组织损伤，高剂量组效果最为明显。