3种不同萃取方法对黑胡椒香气物质的气质联用分析

王珏　钟壹鸣　孙也乔　胡丽松　伍宝朵　郝朝运　范睿

摘  要：為探究不同提取方法对黑胡椒挥发性成分的影响，本研究以黑胡椒为材料，利用顶空固相微萃取法（HS-SPME）、戊烷∶乙醚（1∶1）溶剂萃取法和甲基叔丁基醚（MTBE）溶剂萃取法对黑胡椒中的香气成分进行提取，结合气相色谱质谱联用法（gas chromatography-mass spectrometry）和主成分分析法（PCA）对提取的香气物质进行分析。3种提取方法共得到6类（烯类、醇类、酚类、烃类、崁类、烯类氧化物）33种物质。戊烷∶乙醚（1∶1）溶剂萃取法、MTBE溶剂萃取法及顶空固相微萃取法分别检测到25、23、27种挥发性化合物，其中，相对含量较高的化合物均为3-蒈烯、柠檬烯、β-石竹烯、β-蒎烯。2种溶剂萃取法中，戊烷∶乙醚（1∶1）溶剂萃取法检测到的特有化合物有α-松油烯、α-松油醇、β-金合欢烯;与2种溶剂萃取法相比，顶空固相微萃取法（HS-SPME）检测到的特有化合物有樟脑、4-萜烯醇、2-（4-甲基苯基）丙-2-醇、橙花醇、香树烯、β-甜没药烯和愈创兰油烃。结合主成分分析得出，β-蒎烯、3-蒈烯、柠檬烯、β-石竹烯对黑胡椒香气风味贡献率较大，其中顶空固相微萃取法（HS-SPME）与2种溶剂萃取法所得成分差异明显。在溶剂萃取法中，戊烷∶乙醚（1∶1）溶剂萃取法优于MTBE溶剂萃取法。溶剂萃取法与顶空固相微萃取法所得物质在种类与数量上均存在差异。在胡椒香气物质检测时，将2种方法相结合可以更大程度保证所得化合物种类的丰富性和全面性。

关键词：黑胡椒;溶剂萃取;顶空固相微萃取;气质联用中图分类号：S573.9      文献标识码：A

Analysis of Aroma Substances in Black Pepper by Three Different Extraction Methods by GC-MS

Abstract： The study was aimed to explore the effects of different extraction methods on the volatile components of black pepper. Using black pepper as the material， headspace solid phase microextraction （HS-SPME）， pentane∶diethyl ether （1∶1） solvent extraction and MTBE solvent extraction were used to extract the aroma components in black pepper， and gas chromatography-mass spectrometry combined with principal component analysis （PCA） was used to analyze the extracted aroma substances. A total of 33 substances in 6 categories （alkenes， alcohols， phenols， hydrocarbons， olefins， and olefin oxides） were obtained under the three extraction methods. 25， 23， 27 volatile compounds were respectively detected in the pentane∶diethyl ether （1∶1） solvent extraction method， MTBE solvent extraction method and headspace solid phase microextraction method. The compounds with relatively high content of volatile compounds obtained by the three extraction methods were 3-carene， limonene， β-caryophyllene， and β-pinene. α-terpinene， α-terpineol， β-farnesene were only detected in the pentane∶diethyl ether （1∶1） solvent extraction method. Camphor， 4-terpene alcohol， 2-（4-methylphenyl） propan-2-ol， and nerol， alloaromadendrene， β-Bisabolene and guaiazulene were only found in HS-SPME. Combined with principal component analysis （PCA）， β-pinene， 3-carene， limonene， and β-caryophyllene contributed significantly to the aroma and flavor of black pepper. Among them， the composition of HS-SPME and the two solvent extraction methods were significantly different. In the solvent extraction methods， the pentane∶diethyl ether （1∶1） solvent extraction method was better than the MTBE solvent extraction method， and there were differences in the types and quantities of substances obtained by the solvent extraction method and the headspace solid phase microextraction method. In the detection of pepper aroma substances， the combination of the two methods could ensure the richness and comprehensiveness of the obtained compounds to a greater extent.E85B7C94-6317-4903-BD2E-2EAFB6888C19

Keywords： black pepper; solvent extraction; headspace solid phase microextraction; gas chromatography-mass spectrometry

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2022.05.020

胡椒（Piper nigrumL.）为胡椒科（Piperaceae）胡椒属（Piper）多年生常绿藤本植物，原产于印度^[1]，是世界上重要的香辛料作物，素有“香料之王”和“黑色黄金”的美誉^[2]。目前，市面上按照胡椒不同的加工方式可将其分为黑胡椒、白胡椒和青胡椒3种类型。其中，黑胡椒由胡椒果不脱皮直接干燥而成^[3]。黑胡椒經常作为香料和调味料应用于食品工业中，因其精油具有良好的防腐^[4]和抗氧化作用^[5]，黑胡椒也可作为腌制食品的天然防腐剂和抗氧化剂^[6]。前人研究发现，胡椒属资源可检测到较多种类的化合物，但是对于胡椒属资源化合物的提取鉴定方法研究相对较少，还需进行深入探索研究。

香气成分提取技术主要有液-液萃取（LLE）^[7]、超临界流体萃取法（SFE）^[8]、顶空-固相微萃取（HS-SPME）^[9]和水蒸气蒸馏法（DDE）^[10]等。柳中等^[11]采用固相微萃取法（SPME）、水蒸气蒸馏法（DDE）和同时蒸馏萃取法（SDE）3种方法对海南省黑、白胡椒化学成分进行提取分析，共得96种物质，主要是烯烃类物质;侯冬岩等^[12]采用蒸馏萃取法对黑胡椒进行萃取后得到28种化合物，主要成分为萜类化合物。前人对胡椒物质的鉴定方法多为固相萃取、水蒸气蒸馏和超临界流体萃取等方法，提取物质主要为萜烯类化合物，目前胡椒香气成分提取技术正趋于完善和成熟，但其提取过程中受温度、压力、时间等因素的影响。现有的提取方法在生产中都具有可行性，但是仍存在一些不足。而胡椒属植物资源需要通过野外收集，此途径导致很难获得大量原材料，其中鉴定评价是胡椒属植物资源创新利用的根本，因此亟需建立一种快速用于鉴定胡椒游离态物质的新技术。

本研究采用顶空固相微萃取（HS-SPME）、戊烷∶乙醚（1∶1）溶剂萃取和MTBE溶剂萃取3种方法对胡椒样品挥发性成分进行萃取，利用气质联用检测分析其主要物质组成及含量的一致性与差异性。研究结果将对胡椒物质的提取方法进行优化补充，也为胡椒溶剂萃取提供更为多样的解决方案。

1  材料与方法

1.1 材料

供试黑胡椒由中国热带农业科学院香料饮料研究所提供，采摘胡椒种质圃的红色成熟胡椒果进行热烫法处理，条件为温度70℃，时间30 s。热烫法处理结束后及时进行冷却，将其放置于旋转鼓风干燥箱中进行干燥，条件为温度40℃，时间10 h。

Trace 1300-ISQ气相色谱-离子阱质谱联用仪（美国赛默飞世尔公司）;HPG-9240A精密鼓风干燥箱（上海一恒科技有限公司）。

1.2  方法

1.2.1  戊烷∶乙醚（1∶1）溶剂萃取  精确称取2.0 g黑胡椒样品置于液氮中，研磨成粉后置于50 mL离心管中加入10 mL戊烷∶乙醚（V∶V=1∶1）。置于16℃的摇床中进行轻微振荡30 min，重复2次。将2次过滤后的上清液混匀并加入无水硫酸钠进行干燥。经有机相针式滤器（13 mm， 0.22 μm）过滤提取液后抽取0.5～1.0 mL置于1.5 mL棕色萃取瓶中，用于GC-MS检测挥发性成分。设置3次生物学重复。

1.2.2  MTBE溶剂萃取  精确称取2.0 g黑胡椒样品置于液氮中，研磨成粉后置于50 mL离心管，加入15 mL甲基叔丁基醚（MTBE）混匀后超声萃取，时间为1 h，温度55℃;萃取后通过尼龙膜分离滤渣与滤液，向滤液中加入一定量的无水硫酸钠进行干燥;利用有机相针式滤器（13 mm， 0.22 μm）过滤提取液后抽取0.5～1.0 mL置于1.5 mL棕色萃取瓶中，用于GC-MS检测挥发性成分。设置3次生物学重复。

1.2.3  顶空固相微萃取  将黑胡椒样品置于研钵中，研磨后过40目筛，精确称取2.0 g黑胡椒粉置于20 mL的顶空瓶中备用。设置3次生物学重复。

1.2.4  GC-MS分析条件  色谱条件：色谱柱为DB-5MS（30 m×0.25 mm×0.25 μm）弹性石英毛细管柱;载气为高纯氦气（99.999%），载气流量0.8 mL/min，分流模式进样，分流比为10∶1，进样口温度230℃，起始柱温度设置为40℃，维持3 min后以5℃/min的升温速率直到220℃，维持2 min。

质谱条件：离子源为EI源，电子能量70 eV，离子源温度150℃，传输线温度250℃，扫描范围为40～450 amu。

将样品检测结束后，利用GC-MS系统谱库（NIST11）检索导出结果，通过人工检索和查阅文献确定物质种类并计算其百分含量。

1.3 数据处理E85B7C94-6317-4903-BD2E-2EAFB6888C19

利用Excel 2019和Origin 2018软件对试验数据进行统计及主成分分析，对黑胡椒在3种方法下所得化合物进行分析。

2  结果与分析

2.1  3种萃取方法黑胡椒挥发性成分的GC-MS分析总离子流色谱图

根据上述3种萃取方法，分别将戊烷∶乙醚（1∶1）溶剂萃取、MTBE溶剂萃取、顶空固相微萃取（HS-SPME）结合GC-MS进行分析，通过自带谱库检索分别得到离子流色谱图（图1）。结果显示：戊烷∶乙醚（1∶1）与MTBE溶剂萃取的离子流色谱图差异不显著，2种溶剂萃取与顶空固相微萃取离子流色谱图差异显著，因此，后续对3种萃取方法提取的物质进行分析讨论。

2.2  3种萃取方法的黑胡椒挥发性成分分析

通过黑胡椒挥发性成分的分析结果显示（表1），经3种方法萃取后共检测到33种化合物，主要为萜烯类化合物。萜烯类化合物是一类广泛存在于植物、动物体内的碳氢化合物^[13]。3种萃取方法中，顶空固相微萃取和戊烷∶乙醚（1∶1）溶剂萃取所测得的物质种类较多，分别为27种和25种，MTBE溶剂萃取测得23种化合物。顶空固相微萃取测得挥发性成分主要有β-石竹烯（15.82%±0.00%）、3-蒈烯（10.12%±0.01%）、柠檬烯（7.95%±0.01%）、α-可巴烯（5.91%±0.00%），其特有成分为樟脑（0.05%±0.01%）、4-萜烯醇（0.10%±0.01%）、2-（4-甲基苯基）丙-2-醇（0.04%±0.01%）、橙花醇（0.04%±0.00%）、香树烯（0.09%±0.00%）、β-甜没药烯（0.79%±0.01%）、愈创兰油烃（0.05%±0.01%）;戊烷∶乙醚（1∶1）溶剂萃取的主要成分有3-蒈烯（21.02%±0.00%）、柠檬烯（14.97%±0.01%）、β-石竹烯（14.95%± 0.00%）、β-蒎烯（10.35%±0.01%）、α-水芹烯（7.47%±0.00%）、蒎烯（6.87%±0.00%）;MTBE溶剂萃取的主要成分有3-蒈烯（21.52%±0.00%）、柠檬烯（15.14%±0.01%）、β-石竹烯（15.51%± 0.01%）、β-蒎烯（9.98%±0.01%）、α-水芹烯（6.71%±0.01%）、蒎烯（6.33%±0.00%）。对比MTBE溶剂萃取与戊烷∶乙醚（1∶1）溶剂萃取发现，后者检测到的挥发性成分数量及种类均高于前者，共有的3种化合物为α-松油烯、α-松油醇和β-金合欢烯。

对比分析后发现，β-石竹烯、3-蒈烯、柠檬烯3种萜类化合物在3种萃取方法下的相对含量均最高。柠檬烯（limonene）又名苎烯，是一种单萜烯类化合物，主要存在于柠檬、柑橘、佛手精油中，具有抗氧化、抗炎、抗肿瘤活性、抑菌、利胆溶石、去痰止咳、镇静神经中枢等多种生理功效，大量文献报道，柠檬烯对结肠癌、乳腺癌、胃癌、皮肤癌等癌细胞具有抑制作用^[14]。3-蒈烯是一种双环单萜，是松树精油的主要成分之一，除已知杀菌特性外，还具有抗炎、抗菌和抗焦虑的作用^[15]。与α-可巴烯类似，3-蒈烯作为GABAA-BZD受體的正调节器，具有促进睡眠的作用^[16]。β-石竹烯是一种天然双环倍半萜，具有抗炎、镇痛、神经保护、抗肿瘤、防治肝损伤等广泛的生物活性，并能通过兴奋CB2受体及激活

内源性阿片镇痛系统发挥镇痛作用，激动脊髓等中枢系统的CB受体;以及对神经变性疾病具有神经保护作用^[17]。

2.3  3种萃取方法的黑胡椒挥发性化合物分类

通过GC-MS分析检测可知，3种不同萃取方法共检测出6类化合物，分别为：烯类、醇类、酚类、烃类、崁类以及烯类氧化物。HS-SPME方法下检测到5类化合物共27种，这种方法检测的化合物总数最多，占总数36%。戊烷∶乙醚（1∶1）和MTBE溶剂萃取方法分别检测到5类25种和23种挥发性化合物，其中，戊烷∶乙醚（1∶1）萃取方法检测到烯类化合物数最多，为20种，占比达35.71%。HS-SPME萃取方法检测到的醇类化合物数高于其他2种，有6种（图2）。

2.4  3种萃取方法的黑胡椒挥发性成分的主成分分析

主成分分析（principal component analysis， PCA）是一种把多个复杂指标简化为几个综合指标的统计方法。本研究中3种萃取方法从黑胡椒样品中共检测到33种挥发性成分，以33种挥发性成分构成3×33矩阵进行主成分分析。结果如表2、表3所示，第1主成分方差贡献率为92.811%，对其作出主要贡献的物质有β-蒎烯、3-蒈烯、柠

檬烯、γ-松油烯、α-松油醇、β-石竹烯、β-金合欢烯、大根香叶烯D、γ-古芸烯、氧化石竹烯，其对应的特征向量均大于1;第2主成分的方差贡献率为7.168%，对其作出主要贡献的物质有δ-榄香烯、α-可巴烯、α-律草烯，其对应的特征向量均大于0.5。由表2可知，第1和第2主成分的累计贡献率达99.979%，由此可见第1、第2主成分充分展现了原始变量的主要信息，也达到了此次进行主成分分析的目的。

从表3可知β-蒎烯、3-蒈烯、柠檬烯、β-石竹烯与第1主成分呈高度正相关，对黑胡椒的挥发性香气影响较大;α-可巴烯、β-石竹烯对第2主成分的香气影响起到了决定性作用;δ-榄香烯成分在第3主成分中起到一定的作用。由黑胡椒

挥发性成分在主成分分析下的得分图（图3）可知，在PC1方向上3种萃取方法检测到的挥发性成分差异显著，大致可以分为3类：β-石竹烯为一类;β蒎烯、3-蒈烯、柠檬烯、萜品油烯及δ-榄香烯为一类;剩余的化合物归为一类;而在PC2方向上各物质差异不显著。E85B7C94-6317-4903-BD2E-2EAFB6888C19

3  讨论

前人的研究多以水蒸气蒸馏法和超临界CO₂萃取法对胡椒中的香气成分进行提取^[18]，与本研究的3种萃取方法所得结果进行对比分析，探讨溶剂萃取法与传统方法间的异同之处。

3.1 顶空固相微萃取（HS-SPME）与2种溶剂萃取的对比

本研究中顶空固相微萃取（HS-SPME）结合GC-MS检测到黑胡椒中主要的挥发性成分有β-石竹烯（15.82%±0.00%）、3-蒈烯（10.12%± 0.01%）、檸檬烯（7.95%±0.01%）、α-可巴烯（5.91%±0.00%），与侯冬岩等^[19]的研究结果相似，该研究利用水蒸气蒸馏法对黑胡椒样品进行萃取，最终结合GC-MS检测到主要成分有石竹烯、蒎烯、蒈烯、柠檬烯;李祖光等^[20]利用固相微萃取结合GC-MS对黑胡椒粉末进行检测后得到海南产黑胡椒特殊成分主要为β-石竹烯（47.30%）、3-蒈烯（11.48%）、β-水芹烯（8.22%）、榄香烯（5.25%）、β-蒎烯（2.43%），其中主要成分为β-石竹烯，与本研究结果一致。本研究中，与顶空固相微萃取相比，戊烷∶乙醚（1∶1）溶剂萃取检测到含量最高的化合物为3-蒈烯，该化合物作为中草药植物中的活性成分可直接通过植物进行利用，也能以天然精油的形式作为中间体或者配方原料用于医药、农药、化妆品等行业^[21]。3种萃取方法检测到的挥发性成分中，含量较高的化合物为β-石竹烯，是一种双环倍半萜型化合物，具有丁香花香味，具有平喘、祛痰和抗炎作用^[22]。通过比较后发现，顶空固相微萃取检测到的特有成分包括樟脑、4-萜烯醇、2-（4-甲基苯基）丙-2-醇、橙花醇、香树烯、β-甜没药烯和愈创兰油烃。其中樟脑因具有特征渗透性和轻微薄荷香气被用于工业产品中的加香环节^[15];橙花醇则常被用于制造香水及柑橘类香精。2种溶剂萃取的特有成分有α-松油烯、α-水芹烯、莰烯、邻伞花烃及β-榄香烯。本研究表明，今后在胡椒游离态物质的鉴定过程中应将顶空固相微萃取法与溶剂萃取法相结合，使胡椒挥发性成分的检测更为全面。

3.2  戊烷∶乙醚（1∶1）萃取与MTBE萃取的对比

前人常利用戊烷∶乙醚（1∶1）有机溶剂萃取法对香草兰^[23]、葡萄酒^[24]等挥发性成分进行检测;利用MTBE溶剂萃取对再造烟叶碎片原料中的香味物质^[25]进行研究。本研究中，戊烷∶乙醚（1∶1）与MTBE溶剂萃取法最终检测到的化合物分别为25种和23种，前者检测效率更高，而且前者比后者多检测出α-松油烯、α-松油醇、β-金合欢烯3种物质，其中α-松油醇具有典型的丁香味，是最常用的日化香料物质之一，常用于肥皂和化妆品中。2种溶剂萃取的共有物质中有5种含量较高，分别为：β-蒎烯、α-水芹烯、3-蒈烯、柠檬烯和β-石竹烯，其中β-蒎烯作为日用香料常用于居家用品加香，同时也用于月桂烯的生产;α-水芹烯具有胡椒气味，3-蒈烯具有一定的辛辣味，对黑胡椒的辛辣风味有一定贡献，这些成分都可作为合成香料的主要原料^[11]。综上所述，在黑胡椒的2种溶剂萃取方法中，戊烷∶乙醚（1∶1）萃取优于MTBE溶剂萃取。

3.3  3种萃取方法与传统方法——水蒸气蒸馏法的对比

柳中等^[11]在对海南黑、白胡椒香气成分的分析中，分别使用了固相微萃取、水蒸气蒸馏法及同时蒸馏萃取法，其中采用水蒸气蒸馏法共鉴定出37种化合物，其主要成分为3-蒈烯、α-水芹烯、β-月桂烯、柠檬烯、石竹烯等烯烃类物质。黄菲菲等^[26]利用水蒸气蒸馏法对4种方式处理的黑胡椒香气成分进行分析，分别鉴定出19、17、23、22种化合物，总检出量在95%以上;在检出物质中α-蒎烯、β-蒎烯、3-蒈烯、柠檬烯、蛇麻烯、β-石竹烯、β-甜没药烯等在4种处理方式检测产品中的含量较高，最高的为β-石竹烯。侯冬岩等^[19]对水蒸气蒸馏法提取黑胡椒的挥发性成分及其萜类化学成分进行分析，鉴定出黑胡椒挥发油中存在37个化合物，主要有β-蒎烯、3-蒈烯、α-水芹烯、柠檬烯、石竹烯、α-松油醇等。区敏港等^[27]采用水蒸气蒸馏法提取黑胡椒精油，结合GC-MS分析检测到化合物主成分有10种，其中含量较高的为α-蒎烯、石竹烯、β-蒎烯、蛇麻烯等。在本研究中，采用3种萃取方法对黑胡椒香气成分进行提取，结合GC-MS分析检测到共有且含量较多的成分有β-蒎烯、3-蒈烯、柠檬烯、β-石竹烯，与前人研究结果相似。

4  结论

本研究以黑胡椒为研究材料，以3种不同萃取方法对黑胡椒香气成分进行提取，经GC-MS分析共检测到33种物质，顶空固相微萃取法检测到的27种物质中其特有成分为樟脑、4-萜烯醇、2-（4-甲基苯基）丙-2-醇、橙花醇、香树烯、β-甜没药烯和愈创兰油烃;戊烷∶乙醚（1∶1）溶剂萃取法和MTBE溶剂萃取法分别获得25种和23种物质，其特有成分共包括α-松油烯、α-水芹烯、莰烯、邻伞花烃及β-榄香烯。溶剂萃取法与顶空固相微萃取法相比，所得物质在种类与数量上均存在一定差异。2种方法相互补充可以在胡椒属植物香气物质鉴定中得到更加全面的检测结果。

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