响应面法优化莼菜多糖的提取工艺及其抗氧化活性的研究

李娉婷，廉争皓，朱 芹，许明峰

(杭州师范大学生命与环境科学学院，浙江 杭州 311121)

莼菜(Braseniaschreberi)为原始花被亚纲睡莲科莼菜属多年生淡水水生草本植物[1]，原产于我国的浙江、四川、重庆等地[2]，其叶片表面有胶状物质包裹.莼菜营养价值丰富，含有多种氨基酸、蛋白质、多糖等人体生命活动所必需的营养物质[3-4]，其中铁、锌含量较多[5]，莼菜多糖还具有调节免疫、抗氧化、降血脂等功效[6-7].

莼菜的各个部位均可食用，在传统烹饪中，嫩叶部分常用来煲汤、制作糕点等.贾于晶等[8]研究了莼菜清蛋糕的制作流程与最佳工艺，鲜瑶等[9]利用正交试验得出莼菜保健面包的最佳工艺条件.莼菜还有净化水质作用，可用于水污染的处理.朱秀红等[10]研究发现莼菜可以适应在污染水体中的培植,能有效地吸收富营养化水体中的氮、磷等物质,既可以美化水域景观，又可以恢复水体生态环境，具有较高的经济价值.但目前对莼菜多糖及其提取工艺的研究还比较少.

本研究以西湖莼菜为原料，通过响应面分析法对莼菜多糖的提取工艺进行优化并测定其抗氧化活性，为莼菜的深度开发利用提供理论依据.

1 材料与方法

1.1 仪器和设备

可见分光光度计(722E，上海光谱仪器有限公司)；分析天平(感量0.000 1 g，FA3204B，上海精科天美科学仪器有限公司)；RE-52AA旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)；循环水式多用真空泵(SHB-Ⅲ，郑州长城科工贸有限公司).

1.2 材料和试剂

新鲜西湖莼菜，购于浙江杭州.氢氧化钠溶液、无水乙醇、氯仿、正丁醇、苯酚、浓硫酸(均为分析纯).葡萄糖标准品、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)粉末、Vc标准品(均为基准试剂).

1.3 实验方法

1.3.1 水提醇沉提取莼菜多糖

取新鲜莼菜，于70 ℃热风干燥8 h后匀浆机粉碎.取莼菜粉末，无水乙醇回流脱脂处理.称取0.5 g脱脂后的样品，在不同条件(超声波功率、提取时间、提取温度、液料比)下加0.5%氢氧化钠溶液作为溶剂进行超声提取.提取后的混合物经4 500 r/min离心10 min，取滤液，加入适量的氯仿、正丁醇(滤液、氯仿、正丁醇的体积比为25∶5∶1).将混合物剧烈震摇20 min，离心去除蛋白质后，取上清液5 mL，加乙醇至乙醇体积分数为80%，4 ℃过夜，混合液5 000 r/min离心15 min得粗多糖.

1.3.2 莼菜多糖提取率的测定

采用蒽酮-硫酸比色法测定莼菜多糖的浓度[11].以葡萄糖溶液的质量浓度(μg/mL)为横坐标，490 nm波长下测得的吸光度为纵坐标绘制标准曲线，所得方程为y=0.011 1x+0.015 2,R2=0.998 9.

按以下公式计算多糖的提取率：

ω=C×10-3×V×N/m×100%.

式中：C为标准葡萄糖质量浓度(μg/mL)；V为提取液体积(mL)；N为稀释倍数；m为莼菜质量(mg).

1.3.3 单因素试验

固定其余条件不变，采用单因素试验，研究不同提取时间、温度、液料比、超声波功率等因素对莼菜多糖提取率的影响.固定液料比40∶1、提取温度70 ℃、超声波功率200 W条件下，考察提取时间(10、20、30、35、40、45 min)对多糖提取率的影响.固定液料比40∶1、提取时间30 min、超声波功率200 W条件下，考察提取温度(50、60、65、70、75、80 ℃)对多糖提取率的影响.固定液料比40∶1、提取时间30 min、提取温度70 ℃条件下，考察超声波功率(50、100、150、200、250、300 W)对多糖提取率的影响.固定提取时间30 min、提取温度70 ℃、超声波功率200 W条件下，考察液料比(20∶1、30∶1、35∶1、40∶1、45∶1、50∶1)对多糖提取率的影响.

1.3.4 莼菜多糖抗氧化活性的测定

以95%的甲醇为溶剂，将待测多糖样品和Vc标准品分别配制成0.125、0.25、0.5、1、2、3、4 mg/mL的溶液.分别取1 mL 20 μmol/L的DPPH溶液与3 mL上述系列溶液，具塞试管中充分混匀后置于阴暗处，室温下反应30 min，测定混合溶液在520 nm处的吸光度.

莼菜多糖的抗氧化活性用DPPH自由基清除率表示，计算公式为:

DPPH自由基清除率=[1-(Ai-Aj)/A0]×100%.

2 结果与讨论

2.1 超声辅助提取中单因素对莼菜多糖提取率的影响

2.1.1 液料比对莼菜多糖提取率的影响

由图1可知，在提取温度、提取时间、超声波功率固定的情况下，莼菜多糖的提取率在一定范围内随液料比的增加而增加.当液料比处于较低水平(20∶1)时，提取率较低，原因可能是提取溶剂较少、原料过多而导致的提取不充分.此问题可通过提高液料比解决.当液料比由20∶1增加到40∶1时，可明显观察到提取率的增加，而从40∶1增加到50∶1，提取率却没有明显变化.此现象可能是由于达到最大液料比后，多糖随着提取溶剂量的增加而出现一部分的分解导致.综上所述，液料比的增加无疑会带来成本的提高，为达到节约资源和成本的目的，理想的液料比可设为40∶1～60∶1.

图1 不同液料比对莼菜多糖提取率的影响 Fig.1 Effect of different liquid-solid ratio on yield rate of polysaccharides from Brasenia schreberi图2 不同提取温度对莼菜多糖提取率的影响 Fig.2 Effect of different temperature on yield rate of polysaccharides from Brasenia schreberi

2.1.2 提取温度对莼菜多糖提取率的影响

由图2可知，在液料比、提取时间、超声波功率固定的情况下，莼菜多糖的提取率在一定范围内随提取温度的升高而增加.当温度由50 ℃升高至70 ℃时，多糖提取率显著增长，其中以60～70 ℃阶段增长尤为显著.当温度超过70 ℃时，提取率不升反降，推测其原因在于温度过高导致的多糖分解.因此在实验与工业化生产时应尽量避免由于温度过高而带来的损失，最佳提取温度可设为60～80 ℃.

2.1.3 超声波功率对莼菜多糖提取率的影响

在液料比、提取时间、提取温度固定的情况下，莼菜多糖的提取率在一定范围内随超声波功率的增加而增加(图3)，但当功率由50 W增加至200 W时，提取率的增长速度却比液料比、提取温度下的增长速度为慢.当功率达到200 W时可明显观察到峰值的出现，随后多糖提取率有所下降.这可能是由于超声波的空化作用对多糖结构产生影响从而导致其分解，造成原料的损耗.因此，在综合考虑实验成本和提取率的前提下，初步判断最佳功率范围为100～300 W.

图3 不同超声波功率对莼菜多糖提取率的影响Fig.3 Effect of different ultrasonic power on yield rate of polysaccharides from Brasenia schreberi图4 不同提取时间对莼菜多糖提取率的影响Fig.4 Effect of different extraction time on yield rate of polysaccharides from Brasenia schreberi

2.1.4 提取时间对莼菜多糖提取率的影响

由图4可知，在液料比、提取温度、超声波功率固定的情况下，莼菜多糖的提取率在一定范围内随提取时间的增加而增加.当提取时间在10～30 min时，多糖提取率随提取时间基本呈线性变化，并在35 min时达到峰值.当提取时间超过35 min后，多糖可能发生氧化等反应，提取率有所下降.结合时间成本与多糖提取率等实际情况，初步设定最佳提取时间为20～40 min.

2.2 响应面法对莼菜多糖提取工艺的优化

2.2.1 响应面法分析因素水平的选取

有些时候，甲洛洛上街碰到泽仁姆，便开玩笑：泽仁姆，哪天晚上我们还是喝瓶酒吧？泽仁姆总是很开朗：你那小小的身板，有多大的酒量啊？甲洛洛笑开了：你不能只说看得见的地方，看不见的地方大着呢！泽仁姆哈哈大笑：那可要见识见识你的能耐了。

根据Box-Benhnken的中心组合实验设计原理[12]，结合莼菜多糖提取的单因素试验结果，选取液料比、提取温度、提取时间3个对莼菜多糖提取率影响较大的因素，通过三因素三水平的试验方法对提取工艺进行响应面法优化[13]，试验因素与水平设计见表1.

表1 响应面设计试验因素水平及编码Tab.1 Factors and their levels for the response surface design

2.2.2 响应面法优化试验设计方案及结果

以液料比(A)、提取温度(B)、提取时间(C)为单因素，莼菜多糖提取率(Y)为响应值，响应面法设计方案及结果见表2.

表2 响应面设计方案及结果Tab.2 Box-Benhnken design for independent variables and observed responses

利用Design Expert 8.0.5b程序软件对表2中的试验结果进行回归分析，得到莼菜多糖提取率(Y)对液料比(A)、提取温度(B)和提取时间(C)的三元二次回归方程为Y=6.36+0.16A+0.027B+0.44C+0.023AB+0.12AC+0.086BC-0.35A2-0.45B2-0.79C2.

对回归方程进行响应面二次模型的方差分析和显著性检验.由表3可知，回归模型达到极显著水平(P<0.000 1)；失拟项P值为0.405 3，大于0.05，说明二次多项式模型拟合较好，实验误差较小，能够较好地用回归方程来代替真实试验点，进而通过方程拟合各因素对多糖提取率的影响.液料比、提取时间对多糖提取率有显著影响(P< 0.01)，而提取温度对多糖提取率的影响较小.AB、AC、BC三者P值均大于0.01，说明液料比、提取温度、提取时间的两两交互作用对多糖提取率影响不显著.

表3 响应面回归模型的方差分析结果Tab.3 Response variance analysis results of the regression model

续表3

2.2.3 响应面图与等高线图分析

依据多元二次回归方程绘制响应面图可直观地反映出不同因素之间的交互作用，并确定各个因素的最佳取值范围.等高线图则可反映两因素之间交互作用的强弱，当等高线为椭圆时，表明两因素交互作用显著，等高线为圆形时交互作用不显著[14-15].图5—7为液料比、提取时间、提取温度3个因素在三水平上对莼菜多糖提取率的响应面曲线和对应的等高线图.

图5 提取时间和液料比交互作用对莼菜多糖提取率的响应面及其等高线Fig.5 Interaction of time and liquid-solid ratio on the yield of polysaccharides and its contour

由图5可见，三维图形中响应面倾斜程度较小且较圆，表明液料比和提取时间二者的交互作用对莼菜多糖提取率的影响并不大.等高线图显示极值点位于等高线椭圆圆心处，表明在合适的液料比、提取时间下可得到最佳提取率.当液料比不变时，多糖提取率随时间的增加表现出先增加后减少的趋势；当提取时间不变时，多糖提取率随液料比的增加先增加后趋于平缓.

液料比和提取温度二者的交互作用对莼菜多糖提取率的影响不显著，但相较而言，提取温度影响较大，因此，在图6所示三维响应面图中可观察到提取温度面较液料比更为倾斜、陡峭.在等高线图中，极值点存在于圆心处.由此可见，适当液料比、提取温度的条件下，莼菜多糖的提取率可达到最大.当液料比固定时，多糖提取率随提取温度的升高而增加，达到最大值后缓慢减少.同理，当提取温度固定时，多糖提取率随液料比的增加而增加.

图6 提取温度和液料比交互作用对莼菜多糖提取率的响应面及其等高线Fig.6 Interaction of temperature and liquid-solid ratio on the yield of polysaccharides and its contour

图7结果表明，提取时间与提取温度二者交互作用对多糖提取率的影响较小.在三维响应面中，曲面倾斜程度不大且较为平缓，而极值点位于等高线图的圆心位置，表明在适当提取温度、提取时间下，可达到最佳提取率.在等高线图中，当提取时间为30 min时，多糖提取率随提取温度的变化最为明显.当提取温度不变时，多糖提取率随提取时间的增加先上升后缓慢下降.

图7 提取时间和提取温度交互作用对莼菜多糖提取率的响应面及其等高线Fig.7 Interaction of time and temperature on the yield of polysaccharides and its contour

2.2.4 最佳工艺条件的预测及验证

根据响应面分析数据及各交互作用所得二维、三维图形可确定液料比(A)、提取时间(C)、A2、B2、C2对多糖提取率有较显著影响，B、AB、AC、BC四者对多糖提取率影响较小.由此推断各种因素对莼菜多糖提取率的影响不是简单的线性关系，可通过得出的回归方程确定最佳提取工艺：超声波功率200 W，液料比42.82∶1，提取时间30.66 min，提取温度73.04 ℃，此条件下多糖提取率为6.454%.为验证数据可靠性，结合试验条件与工艺水平，在超声波功率200 W、液料比43∶1、提取时间31 min、提取温度73 ℃条件下，进行3次重复试验，得多糖的平均提取率为6.446%，与理论预测值较为接近.综上所述，此响应面法优化莼菜多糖提取的工艺参数可靠.

2.3 莼菜多糖抗氧化活性的研究

由图8可见，莼菜多糖具有一定的抗氧化活性，并且在一定范围内呈现浓度依赖的趋势：当莼菜多糖质量浓度较低时，抗氧化活性较低，当质量浓度达到3 mg/mL时，莼菜多糖和Vc对DPPH自由基的清除率分别达到39.62%和100%，可见莼菜多糖也具有较强的抗氧化活性.因此莼菜多糖作为一种天然活性物质，具有一定的开发潜力.

图8 不同质量浓度的Vc与莼菜多糖对DPPH的清除率Fig.8 The clearance rate of DPPH of Vc and polysaccharides with different concentration

3 结论

本试验利用超声辅助提取得到莼菜多糖，通过响应面法优化了多糖的提取工艺，其最佳提取条件为超声波功率200 W、液料比42.82∶1、提取时间30.66 min、提取温度73.04 ℃，此条件下多糖提取率为6.454%.此外，通过DPPH法得到莼菜多糖最大的DPPH自由基清除率为39.62%，具有较强的抗氧化活性.本研究为莼菜多糖的开发利用提供了一定的理论依据.