西州密25 号哈密瓜叶片再生体系建立

刘丽锋，古勤生，周建华

（1.中国农业科学院郑州果树研究所 郑州 450009； 2.郑州市蔬菜研究所 郑州 450015）

西州密25 号是新疆维吾尔自治区葡萄瓜果研究中心廖新福研究员团队于2007 年选育的哈密瓜类型甜瓜品种，由于富含多种维生素，色泽鲜艳，口感鲜甜，营养丰富，经济价值高，因此深受消费者喜爱。但山高水远，内地消费者很难吃到新鲜的哈密瓜，为打破地域限制，研究人员对哈密瓜“东移”“南移”开展研究，除新疆外，甘肃、陕西、安徽、内蒙古、山东、云南、广东、广西、海南等地区开始大面积引种种植。中国农业科学院郑州果树研究所西瓜甜瓜病虫害防控课题组于2011 年引种在河南省进行示范推广种植，目前在河南省年均推广面积高达67 hm，并呈逐年增加的趋势。随着生活水平的不断提高，人们对果蔬品质的要求逐渐提升，为了满足消费者对高品质哈密瓜的需求，通过人工辅助选择筛选高品质的哈密瓜实现定向育种是目前遗传育种的热点。哈密瓜离体培养是哈密瓜品种改良、遗传转化的前提条件。其中，再生能力是关键因素，再生能力的差异除了基因型影响外，外植体类型不同导致的再生能力也不同。目前，甜瓜主要以子叶为外植体再生形成完整植株的途径较多，但利用叶片作为外植体获得再生植株途径的文献报道较少。不同类型外植体对甜瓜再生植株的倍性会产生影响，有研究表明甜瓜子叶诱导丛生芽的途径容易发生倍性变化，而甜瓜经叶片途径诱导会获得大量二倍体植株，降低倍性干扰概率。西州密25 在河南省表现品质稳定，容易坐果，抗病性强，利用叶片诱导丛生芽获得再生植株，避免倍性干扰，是实现转基因甜瓜的主要条件。笔者以西州密25 号叶片作为外植体，设计不同的激素组合、暗培养时间等条件，对组培苗哈密瓜叶片和温室栽培的哈密瓜叶片诱导丛生芽；设计不同激素浓度对伸长苗诱导生根，以期建立一套高效的哈密瓜叶片再生体系，为哈密瓜转基因技术提供新的途径。

1 材料与方法

1.1 试验时间和地点

试验于2019 年3 月至2020 年10 月在中国农业科学院郑州果树研究所果树瓜类生物学重点实验室、西瓜甜瓜病虫害防控课题组玻璃温室进行。

1.2 材料

供试材料为哈密瓜西州密25 号种子，由中国农业科学院郑州果树研究所西瓜甜瓜病虫害防控课题组提供。

1.3 方法

1.3.1 无菌苗培养 西州密25 号成熟种子剥去外壳后，70%酒精消毒30 s，0.1%氯化汞加2 滴Tween-20 杀菌10 min。无菌水冲洗5 次后，浸泡在无菌水中过夜，第2 天播种到1/2 MS+10 g·L蔗糖培养基上，置于组织培养室正常光周期培养条件下进行培养（光照16 h，黑暗8 h，温度25℃，如无特别说明，无菌苗都在此环境中生长），待长出2～3 片真叶时，作为外植体使用。

1.3.2 温室苗培养 西州密25 号成熟种子在水中浸泡3 h，然后用纱布包住，放入30 ℃恒温培养箱，2～3 d 后胚根伸出，播入光照充足的玻璃温室（昼28 ℃/夜20 ℃）的花盆中，待长出2～3 片真叶时，采回实验室，在自来水下冲洗2 h，然后用70%酒精消毒30 s，0.1%氯化汞加2 滴Tween-20 杀菌5 min。无菌水冲洗5 次后作为外植体。

1.3.3 丛生芽诱导 将上述2 种处理的叶片作为外植体，切掉叶片四周边缘，然后再将叶片切成5 mm×5 mm 的方块接种到12 种丛生芽诱导培养基上（表1）诱导丛生芽；将无菌苗叶片接种到诱导培养基MS+2.0 mg·LBA+0.2 mg·LIAA，分别暗培养0、3、6、9、12、15 d，然后转移到培养室光下培养，每处理3 次重复，每次重复9 个叶片，30 d 后观察丛生芽生长情况并统计丛生芽诱导率。

表1 12 种诱导丛生芽分化的培养基组合

1.3.4 生根培养基 当不定芽伸长至2～3 cm 时，从基部切下转接到以下8 种不同的生根培养基R1～R8，即1/2MS+（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0）mg·LIBA 诱导生根，每处理3 次重复，每次重复9 个伸长苗，30 d 观察生根数、根长以及根系生长情况并统计。

愈伤组织诱导率/%=形成愈伤组织的叶片数/接种叶片数×100；

丛生芽诱导率/%=形成丛生芽的叶片数/接种叶片数×100。

1.4 数据分析

采用IBM SPSS Stastistic 22 软件进行单因素方差分析和差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 不同激素浓度对西州密25 号叶片诱导丛生芽的影响

由表2 可以看出，将2 种类型的叶片接种到不同浓度激素的12 种培养基上，叶片愈伤组织诱导率和丛生芽诱导率均有一定差异。在无菌条件下生长10 d 的无菌苗幼嫩叶片，在不同的培养基上均可以诱导愈伤组织，MS6、MS9、MS11 三种培养基诱导愈伤组织相对较高，分别达92.6%、96.3%、92.6%；丛生芽诱导率相对较高的是MS4、MS5、MS11 培养基，均为14.8%，MS2、MS6、MS7、MS10和MS12 等5 种培养基均未诱导出丛生芽；在这2种激素组合情况下，无菌苗叶片虽然能够诱导丛生芽，但是诱导率很低。而温室培养的叶片，愈伤组织诱导率在MS3、MS5、MS6、MS9、MS11 和MS12等6 种培养基中都可达100%，MS1 愈伤组织诱导率最低，为85.2%；不同的培养基均可以诱导丛生芽，MS11 培养基上诱导的丛生芽再生率高达85.2%，MS1 培养基诱导丛生芽效率最低，达25.9%，均高于无菌苗叶片诱导丛生芽的效率。结合无菌苗叶片和温室叶片诱导丛生芽的情况，MS11相对其他培养基效果最好。

表2 激素浓度对甜瓜叶片诱导丛生芽的影响

2.2 暗培养对丛生芽诱导的影响

由表3 可以看出，叶片在正常光周期培养条件下，即暗培养0 d，将叶片直接切下接种到诱导培养基3～4 d 后，叶片膨大，15 d 左右切口处出现愈伤组织，30 d 时绿色愈伤组织诱导率达48.1%，此时丛生芽在绿色愈伤组织部位萌发，陆续出现芽点，丛生芽诱导率可达37.0%；暗培养12 d，30 d 时绿色愈伤组织诱导率可达37%，丛生芽诱导率达66.7%；暗培养15 d，30 d 时绿色愈伤组织诱导率为11%，丛生芽诱导率达48.2%。暗培养12 d 丛生芽诱导率达最高，为66.7%。其他时间丛生芽诱导率没有显著差异。光照对西州密25 号叶片产生愈伤组织和丛生芽的诱导影响较大。经过0～15 d 不同时间的暗培养，叶片均可以诱导愈伤组织，愈伤组织诱导率为100%。经过暗培养的叶片，从暗处刚转移到正常光周期培养条件下，叶片为浅黄色、愈伤组织均为白色，经过1～2 d，叶片很快转为绿色，愈伤组织呈现白色、浅黄色，30 d 后愈伤组织有的仍然呈现白色疏松状，这种类型的愈伤组织只会膨大，不能诱导出丛生芽（图1 白色箭头指示）；有的呈现绿色紧致状，逐渐分化出绿色芽点，诱导形成丛生芽（图1 红色箭头指示，图2 显微镜下绿色致密愈伤组织诱导生成丛生芽状态）。

表3 暗培养对甜瓜叶片诱导丛生芽的影响

图1 两种类型愈伤组织及丛生芽

图2 显微镜下绿色愈伤组织诱导丛生芽

2.3 不同IBA浓度对生根的影响

西州密25 号叶片诱导获得的丛生芽在MS+0.5 mg·LBA 培养基继代培养，当不定芽伸长到2 cm 时，切下转移到8 种生根培养基，7 d 后出现不定根，15 d 左右长成完整植株。由表4 可以看出，8种生根培养基均可以诱导不定芽生根，说明西州密25 生根容易，IBA 质量浓度为0.5～4.0 mg·L均可以诱导生根，在R2、R3、R6、R7、R8 等5 种培养基中生根率均可达到100%，在R1 培养基中生根率较低，也可以达到71.4%。结合根的数量和主根长度，R2 生根培养基优于其他培养基。

表4 不同IBA 浓度对生根的影响

3 讨论与结论

外植体的选择对于组织培养再生体系的建立至关重要，甜瓜子叶诱导丛生芽效率最高，是首选的外植体。叶片可以通过继代培养组培苗以及大田、温室种植的植株被源源不断地提供，再生不容易产生倍性变化，尤其对于稀有甜瓜品种，利用叶片作为外植体意义重大。王福兰等利用甘甜一号无菌苗叶片诱导不定芽，再生率达到91%；冯凤娟等利用西甜一号继代3 周的2～3 片新梢叶片诱导不定芽，再生率最高可达91%；GUIS 等采用生长10 d 的法国当地品种无菌苗叶片诱导不定芽，再生率达72%；Kintzios 等利用温室生长的Galia 第1片真叶诱导不定芽，再生率达60%。Yadav 等利用Hale’s Best Jumbo 组培苗叶片和温室生长的叶片诱导不定芽，再生率分别为8%和80%以上。

笔者采用组培苗叶片和温室生长的甜瓜叶片诱导不定芽，继代生长10 d 的无菌组培苗幼嫩叶片，在培养基MS+2.0 mg·LBA+0.2 mg·LIAA 中诱导丛生芽效率相对较高，达14.8%；温室培养的植株叶片在MS+2.0 mg·LBA+0.2 mg·LIAA 培养基中的丛生芽诱导率高达85.2%。结果与Yadav等的试验结果相似，温室生长的叶片再生率远高于无菌苗诱导丛生芽的再生率，原因可能与光照、温度等外在培养环境条件，以及甜瓜植株生长形态、基因型、叶片年龄等都有关系，继代培养的甜瓜叶片生理和生化都产生了变化，器官发生能力下降，再生率也会降低。

暗培养对很多植物再生是必需条件。已有研究表明，黑暗条件可以减少植物酚类物质的溢出，有利于不定芽的分化。也有研究指出，黑暗条件会导致植物体内生长素增多，促进愈伤组织的形成，不利于不定芽的分化。冯凤娟等试验结果表明，直接转入正常光周期比经过暗培养有利于不定芽的再生。本试验结果表明，暗培养一定时间有助于甜瓜叶片诱导丛生芽，暗培养12 d，丛生芽的诱导率最高，可以达到66.7%。结论不同的主要原因可能是基因型、外植体类型、激素种类及浓度等不同。暗培养的作用机制复杂，其对外植体再生芽的诱导机制需进一步研究。

甜瓜生根相对容易，添加不同浓度的IAA、IBA诱导甜瓜生根率达70%以上。本试验结果表明，1/2 MS 培养基中添加0.5～4.0 mg·LIBA 均可诱导生根，在培养基1/2 MS+1.0 mg·LIBA 中，生根效果最好，平均根数达到7.7，主根长达到9.6 cm，生根率达到100%。

甜瓜基因型不同、外植体来源不同、激素条件不同，均会导致试验结果不完全一致，但是可以利用叶片诱导获得丛生芽，本试验为以后科研工作者利用甜瓜叶片诱导丛生芽提供了参考依据。