CO2麻醉对中华蜜蜂处女蜂王卵巢发育的影响

周建阳, 宋华莉, 邓 萍, 陶坤伶, 唐相友,燕乐乐, 张小燕, 石 鹏, 许金山,*

(1. 重庆师范大学生命科学学院, 重庆 401331; 2. 活性物质生物技术教育部工程研究中心, 重庆 401331;3. 重庆市媒介昆虫重点实验室, 重庆 401331)

群居性社会昆虫通常具有明显的生殖分工，一个雌性个体担任群体的繁殖工作，而其他雌性个体的繁殖能力受到抑制(Khila and Abouheif, 2008, 2010)。繁殖由一个雌性个体完成，这种繁殖方式有利于维持群居社会的稳定，对群居性社会昆虫至关重要(Duncanetal., 2016)。蜜蜂作为群居性社会昆虫的典型代表，同样也保留着这一生殖特性。蜂王负责繁衍后代，而工蜂生殖受到限制，主要负责巢内外工作。

在大多数动物中，长寿通常是以牺牲繁殖能力作为代价的，但蜂王却不存在繁殖与寿命之间的权衡(Finch and Ruvkun, 2001; Coronaetal., 2007)。蜂王通常在6日龄左右开始交配，在婚飞过程中平均与12头雄蜂进行交配(Tarpyetal., 2004)。交配会导致蜂王生理、内分泌和行为等发生深刻的变化(Tanaka and Hartfelder, 2004; Kocheretal., 2008; Vergozetal., 2012)。交配完成后，蜂王将精子储存在受精囊中(Schlüensetal., 2005; Rangeletal., 2021)，除分蜂外一般不再飞出蜂巢。蜂王交配后表现出强大的繁殖能力，并具有更长的寿命(Page and Peng, 2001; Heinze and Schrempf, 2008)。蜜蜂的繁殖能力主要取决于蜂王的生殖性能，而蜂王的生殖性能直接决定着蜂群群势的强弱，并影响着蜂群的维持。因此，对蜂王生殖发育的研究具有重大的意义。

自然条件下，蜂王交配后才开始产卵。交配后蜂王不仅能产下受精卵，也能产下未受精卵，受精卵将发育成雌性蜂，而未受精卵将发育成雄蜂。研究表明，在西方蜜蜂Apismellifera中，未交配的蜂王在经过CO2麻醉后，蜂王会加快卵巢的发育与激活，并产下未受精卵，达到类似于交配后的效果(Harrisetal., 1996; Koywiwattrakuletal., 2005; Thompsonetal., 2007)。昆虫通常含有特定的受体细胞，可以感知和检测环境中CO2(Robertson and Kent, 2009)。蜜蜂利用这类受体来检测环境中的CO2并通过振翅来调节巢房中的CO2浓度(Seeley, 1974; Sudarsanetal., 2012)。正常蜂群中CO2浓度往往低于3%，只有高浓度CO2才能引起蜜蜂的麻醉(Manfredinietal., 2015)。CO2麻醉会对蜂王产生类似于交配的刺激，刺激蜂王分泌更多的神经激素，进而促进卵母细胞的发育以及卵黄发生的起始(Herrmann, 1969; Bergeretal., 2005)。同时，CO2麻醉也会促进蜂王卵黄原蛋白(vitellogenin, Vg)的合成，导致血淋巴中卵黄原蛋白的滴度升高(Engelsetal., 1976)。卵黄原蛋白在卵黄发生过程中起着不可或缺的作用，与蜂王卵巢的发育及产卵的起始有着紧密的联系(Engels, 1974; Koywiwattrakuletal., 2005; 史晶亮等, 2019)。

CO2麻醉能诱导处女蜂王产下未受精卵，形成的单倍体雄蜂是建立染色体遗传与性状关联的理想材料，这为很多科学研究提供了一个良好的生物模型(Vergozetal., 2012; Schulteetal., 2014; Oldroydetal., 2018)。在雄蜂缺乏的时期，也能利用CO2麻醉技术培育出种用雄蜂，解决了育种过程雄蜂缺少的问题，具有重要的生产实践意义。而选择适宜的CO2麻醉条件，诱导处女蜂王产下雄性后代，对种用雄蜂培育至关重要。目前，CO2麻醉对处女蜂王生殖发育影响的研究集中在西方蜜蜂中，而CO2麻醉对我国本土中华蜜蜂Apisceranacerana蜂王生殖发育的影响，尚未有研究报道。中华蜜蜂是中国境内东方蜜蜂Apiscerana的总称，是我国特有的本土蜂种，明确其生殖发育过程及影响因素对于开展中华蜜蜂的种质繁育与改良具有重大意义。据此，本研究以中华蜜蜂作为研究对象，在明确蜂王生殖系统动态发育的研究基础上，分析了不同CO2麻醉条件对中华蜜蜂处女蜂王卵巢发育的影响，有助于我们加深对中华蜜蜂蜂王生殖系统发育动态及影响因素的认知。

1 材料与方法

1.1 供试昆虫

实验蜂群为重庆师范大学蜜蜂种质资源创新基地长期保种的大巴山中华蜜蜂A.ceranacerana，饲养于标准的活框蜂箱中。选取1群群势强(6框足蜂)且蜂王产卵性能较好的蜂群作为移虫育王的母本群，所有培育的新处女王均来自该母本群。选取同样群势且进行失王处理的蜂群12群作为处女蜂王的哺育群。将12群失王后的处女蜂王哺育群分为A, B, C和D共4组，其中A组3群用于处女蜂王生殖发育指标测定；B组3群用于处女蜂王卵巢管细胞分布的观测；C组3群用于CO2麻醉浓度控制处理后处女蜂王的各项指标测定；D组3群用于CO2麻醉次数控制处理后处女蜂王的各项指标测定。将母本群的交尾蜂王所产卵孵育至1日龄幼虫后，分别移入失王哺育群中进行同等条件下的处女王培育，所有实验蜂群加强饲喂，确保巢脾上蜜粉充足。

1.2 人工培育蜂王

1.2.1育王框的准备：从蜂群中采集多余的蜂蜡并将其加热熔化，用台基棒蘸制口径和高度约为8 mm的王台基。将王台基固定在育王框上，再将育王框放入蜂王移除的育王群中，待王台基被工蜂加工至略显收口时即可取出育王框进行移虫育王。

1.2.2移虫育王：控制母本群蜂王产卵6 h，待蜂王产下大量卵子后将产卵脾移至孵化区。3 d后，人工移取1日龄幼虫至固定在育王框的王台基中，再将育王框放入育王群让工蜂对其哺育。每晚对育王群进行奖励饲喂，直至王台封盖为止。

1.3 蜂王羽化后的储存

参考Berger等(2016)的蜂王储存方法，将即将羽化为蜂王的王台放入自制的储王框(固定着王台保护罩的巢框)中，然后将储王框放入原本的育王群中。每隔12 h检查蜂王的羽化情况，并记录蜂王的羽化时间。利用原群的工蜂哺育蜂王，待蜂王发育至对应的日龄时，即可采集蜂王进行试验。

1.4 蜂王生殖发育动态的观测

1.4.1蜂王生殖发育指标的测定：利用3群哺育群共同培育0, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14及16日龄蜂王各3头。用电子天平称量蜂王的体重，完整解剖蜂王的生殖系统，采用LY-WN超清显微系统对蜂王生殖器官进行观察拍照，并利用Toupview形态学测定软件测定蜂王的受精囊直径。完整分离卵巢，利用电子天平测定蜂王的卵巢重，参考许少玉等(1984)的方法分别对两侧卵巢管进行计数，实验重复3次。

1.4.2蜂王卵巢管细胞分布的观测：利用3群哺育群共同培育0, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14及16日龄蜂王各3头。解剖蜂王卵巢，剥离单根卵巢管，用BK6000正置光学显微镜与OPTLite成像系统观察卵巢管中细胞的分布情况，实验重复3次。

1.5 CO2麻醉处理

1.5.1CO2麻醉浓度控制：利用CO2培养箱对蜂王进行麻醉，麻醉时间为8 min。分别在蜂王5日龄与6日龄时各对蜂王麻醉1次，CO2浓度分别设定为50%, 75%与90%，并设定一个不做麻醉处理的对照组(CK)，每组3头蜂王。待蜂王发育至10日龄时，分别测定蜂王的卵巢重、最大卵母细胞长度以及头部Vg基因的相对表达量，实验重复3次。

1.5.2CO2麻醉次数控制：选定75%的CO2浓度作为蜂王的麻醉浓度，麻醉时间仍然保持为8 min。CO2麻醉次数分别设定为1次(蜂王5日龄时麻醉1次)，2次(蜂王5和6日龄时各麻醉1次，总共麻醉2次)与3次(蜂王5, 6与7日龄时各麻醉1次，总共麻醉3次)，并设定一个不做麻醉处理的对照组(CK)，每组3头蜂王。待蜂王发育至10日龄时，分别测定蜂王的卵巢重、最大卵母细胞长度以及头部Vg基因的相对表达量，实验重复3次。

1.6 石蜡切片染色检测蜂王卵巢的发育水平

完整解剖1.5节CO2麻醉处理后的实验蜂王的卵巢组织，并用4%多聚甲醛固定卵巢组织。制作切片的步骤依次经过清洗、脱水、透明、浸蜡、包埋、切片、HE染色与封片(甘海燕等, 2012)。卵巢切片用Nikon Eclipse E100正置光学显微镜与Nikon DS-U3成像系统拍照观察，切换不同放大倍数观察卵巢的整体形态以及卵巢中细胞的分布与发育水平。

1.7 实时荧光定量PCR(RT-qPCR)测定蜂王头部Vg基因的相对表达量

1.7.1样本收集：完整解剖1.5节CO2麻醉处理后的实验蜂王的头部，分别用ddH2O、75%酒精以及DEPC水清洗5 s, 再用灭菌纸吸去多余水分。将样品转移至1.5 mL RNase-free的EP管中，用液氮速冻，最后将样品放置80℃冰箱保存以备后续的实验需求。

1.7.2总RNA的提取与cDNA的合成：以1头蜂王的头部作为1个样品，每组3个平行，实验设计3个生物学重复。总RNA的提取参照Trizol试剂说明书进行操作，利用核酸蛋白测定仪检测总RNA的纯度(OD260/OD280值在1.9～2.1之间为正常情况)，并使用琼脂糖凝胶电泳评估RNA条带的完整性。cDNA第1链的合成参照试剂盒Hifair®Ⅲ 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR(gDNA Digester Plus)的步骤进行。合成的cDNA模板放置于-20℃冰箱保存以备qPCR使用。

1.7.3qPCR测定Vg基因的相对表达量：以不同的处理组蜂王样本的cDNA作为模板，使用软件设计内参基因和目的基因的上下游引物。以东方蜜蜂actin(GenBank登录号: XM_017059067.2)作为内参基因(上游引物：5′-TGCCAACACTGTCCTTTCTG-3′；下游引物：5′-AGAATTGACCCACCAATCCA-3′)，用东方蜜蜂Vg(GenBank登录号： NM_001328484.1)作为衡量生殖发育水平的目的基因(上游引物： 5′-TTAGCGTGGATCTCTCGAAT-3′；下游引物：5′-AAA GTCGGATAATCTCACGTC-3′)。引物序列由生物工程(上海)股份有限公司合成。参考Hieff UNICON®Universal Blue qPCR SYBR Green Master Mix试剂盒的方法进行qPCR。PCR反应体系(10 μL): cDNA 0.4 μL, 上下游引物(10 μmol/L)各0.4 μL, Hieff UNICON®Universal Blue qPCR SYBR Green Master Mix 5 μL, ddH2O 3.8 μL，微离混匀后放入qPCR仪进行定量实验。PCR反应程序: 95℃预变性30 s; 95℃变性5 s, 60℃退火30 s, 共41个循环。溶解曲线从65℃上升至95℃，每5 s升高1℃。每个样本3次技术重复，建立反应的溶解曲线，分别记录actin基因和Vg基因的Ct值，并采用2-ΔΔCt计算Vg基因的相对表达量。

1.8 数据分析

采用SPSS21.0对实验数据进行处理分析，利用单因素ANOVA法进行方差分析，使用LSD多重比较分析数据的显著性差异(P<0.05表示差异显著)。

2 结果

2.1 中华蜜蜂处女蜂王生殖系统的发育动态

为了明确中华蜜蜂处女蜂王生殖系统随日龄的变化动态情况，为CO2麻醉处女蜂王的最佳日龄选择奠定基础,本研究选择对蜂王羽化后不同日龄的卵巢组织的变化情况进行观测统计。结果如图1(A-I)所示，中华蜜蜂蜂王卵巢外部形态在0-6日龄时相对较小，且没有发生明显变化，6日龄后卵巢开始明显膨大，发育完成后，卵巢形态趋于稳定。进一步观察卵巢管的细胞分化情况，结果如图1(J-R)所示：0日龄和2日龄蜂王卵巢管中未见细胞分化，卵巢管全部由未分化的细胞组成；4日龄时卵巢管中出现了细胞的分化，体积较小的滋养细胞围绕在体积较大的卵母细胞周围，此时卵巢管可以区分为端丝区和原卵区2个部分；6日龄时卵巢管中卵母细胞被滋养细胞包裹这一结构更加频繁可见，并且卵母细胞有序地排列在卵巢管中央；8日龄时卵巢管开始出现臆缩，出现了卵室与滋养室的分离，卵室与滋养室交替排布，每个卵室只含有1个卵母细胞，滋养室包裹着大量的滋养细胞，此时卵巢管可以区分为端丝区、原卵区和生长区3个部分(Berger and da Cruz-Landim, 2009; Duncanetal., 2020)。

随着蜂王卵巢的进一步发育，卵巢管的生长区不断变长，原卵区和端丝区开始缩短。约12日龄时(图1: P)，蜂王卵巢管结构开始趋于稳定。稳定后卵巢管末梢由短而细的端丝区和原卵区组成，而卵巢管基部由很长的生长区组成(图2: A)。端丝区分布着许多体细胞来源的端丝细胞(图2: B)。原卵区主要由原始生殖细胞分化而来的早期卵母细胞和滋养细胞组成，其中卵母细胞有序排布在卵巢管中央(图2: C)。在生长区出现了卵室与滋养室的分离，卵室与滋养室交替排列，每个卵室只含有1个卵母细胞，而每个滋养室含有许多的滋养细胞(图2: D)。随着滋养细胞将营养物质输送到卵母细胞(Cavaliereetal., 1998)，越靠近卵巢管基部，卵母细胞体积越大(图2: A)。

图1 中华蜜蜂处女蜂王生殖系统随日龄动态变化Fig. 1 Dynamic changes of reproductive system of virgin queens of Apis cerana cerana with ageA-I: 分别表示0, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14和16日龄蜂王卵巢与受精囊形态特征Morphological characteristics of the ovary and spermatheca of queens at 0-, 2-, 4-, 6-, 8-, 10-, 12-, 14- and 16-d-old, respectively; J-R: 分别表示0, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14和16日龄蜂王卵巢管形态特征Morphological characteristics of ovarioles of queens at 0-, 2-, 4-, 6-, 8-, 10-, 12-, 14- and 16-d-old, respectively. a: 卵巢Ovary; b: 侧输卵管Lateral oviduct; c: 受精囊Spermatheca; d: 螫针Sting; e: 毒囊Venom; f: 卵巢管Ovariole.

图2 中华蜜蜂处女蜂王卵巢发育稳定后(12日龄)卵巢管结构Fig. 2 Ovariole structure of the 12-d-old virgin queen of Apis cerana cerana after stable development of ovaryA: 卵巢管整体结构Overall structure of the ovariole; B: 端丝区Terminal filament; C: 原卵区Germarium; D: 生长区Vitellarium. fc: 滤泡细胞Follicle cells; Gm: 原卵区Germarium; nc: 滋养细胞Nurse cells; oo: 卵母细胞Oocyte; tc: 端丝细胞Terminal filament cells; Tf: 端丝区Terminal filament; Vm: 生长区Vitellarium. 下图同The same for the following figures.

本研究还分别测定了不同日龄蜂王体重、卵巢重、受精囊直径以及卵巢管数目，实验结果如图3所示。 蜂王在初羽化时体重最大，达182.33±4.22 mg。蜂王在羽化后前2 d体重显著下降(P<0.05)。4日龄蜂王的体重显著回升(P<0.05)，之后蜂王的体重将处于一个相对稳定的状态(图3: A)，稳定后体重为153.67±4.00 mg。蜂王卵巢重随日龄发生的变化如图3(B)所示，蜂王在0-6日龄时，卵巢重变化不明显，此时期卵巢重为3.42±0.43 mg，在6-12日龄卵巢重显著增加(P<0.05)，之后将趋于一个相对稳定的状态。稳定后卵巢重为23.74±2.98 mg。 蜂王的受精囊直径不会随着日龄发生明显的波动(图3: C)，不同日龄的蜂王受精囊直径差异不显著(P>0.05)，直径为1.17±0.06 mm。 图3(D)表明，蜂王的卵巢管数目不具有日龄特异性，所有蜂王卵巢管数目的变化范围在160～210条之间，平均为187.81±11.03条。

我们的结果表明，6-12日龄可能是蜂王卵巢发育的关键时期，12日龄后卵巢将处于发育平稳时期。因此，我们的实验将在蜂王5日龄时开始进行CO2麻醉处理，并在10日龄时测定卵巢发育水平的各项指标。

图3 中华蜜蜂处女蜂王特征指标随日龄动态变化Fig. 3 Dynamic changes of characteristic indexes of virgin queens of Apis cerana cerana with ageA: 体重Body weight; B: 卵巢重Ovarian weight; C: 受精囊直径Diameter of spermatheca; D: 卵巢管数目Number of ovarioles. 图中数据为平均值±标准误；折线上方不同字母表示不同成虫日龄间差异显著(P<0.05，Fisher氏LSD多重比较)。Data in the figure are mean±SE. Different letters above the polyline indicate significant differences among different adult day-old ages (P<0.05, Fisher’s LSD test).

2.2 CO2麻醉浓度对中华蜜蜂处女蜂王卵巢发育的影响

为了探索CO2麻醉浓度对中华蜜蜂处女蜂王卵巢发育的影响，我们利用不同浓度CO2连续2 d对蜂王进行麻醉，待蜂王发育至10日龄时检测卵巢的发育水平。不同组10日龄蜂王卵巢重差异如图4(B)所示，结果表明，75% CO2麻醉后蜂王的卵巢重最大，其次分别是50% CO2处理组与90% CO2处理组，卵巢重均高于对照组，其中75% CO2处理组蜂王卵巢重显著高于对照组(P<0.05)。

蜂王卵巢形态与卵巢细胞形态如图4(A)所示，结果表明，50%, 75%与90% CO2处理组蜂王卵巢外部形态大于对照组，卵母细胞的发育水平也明显高于对照组。我们还分别测定了不同处理组10日龄蜂王卵巢中最大卵母细胞的长度(图4: C)，经过CO2麻醉的处理组蜂王卵巢中最大卵母细胞的长度均显著大于对照组(P<0.05)，并且随着CO2浓度的升高，最大卵母细胞的长度依次递增。

qPCR结果(图4: D)表明，Vg基因在10日龄蜂王的头部中均有表达，其中75% CO2麻醉处理后蜂王头部Vg基因的相对表达量最高，其次分别是90% CO2处理组与50% CO2处理组，表达量均高于对照组，并且75% CO2处理组显著高于对照组(P<0.05)。

图4 CO2麻醉浓度对中华蜜蜂处女蜂王卵巢发育的影响Fig.4 Effect of CO2 narcosis concentration on the ovarian development of virgin queens of Apis cerana ceranaA: 蜂王卵巢的HE染色后形态观察Morphological observation of queen ovary after HE staining； B: 卵巢重Ovarian weight; C: 卵巢最大卵母细胞长度Length of the largest oocyte of ovary; D: 蜂王头部中Vg基因相对表达量Relative expression level of Vg gene in queen head. 连续2 d(分别为5和6日龄蜂王时)用不同浓度(50%, 75%与90%)CO2麻醉处理，每次8 min的处女蜂王作为处理组，并设定一个未经麻醉处理的对照组(CK)。待蜂王发育至10日龄时，分别观察卵巢形态特征，测定各组蜂王的卵巢重、最大卵母细胞长度以及头部Vg基因的相对表达量。图中数据为平均值±标准误;柱上不同字母表示差异显著(P<0.05，Fisher氏LSD多重比较)。图5同。The virgin queens narcotized with different concentrations (50%, 75% and 90%) of CO2 in two consecutive days (at the 5- and 6-d-old, respectively) for 8 min were used as the treatment groups, and those not subjected to CO2 narcosis as the control group (CK). The morphological characteristics of the ovary of the 10-d-old queens were observed, and the length of the largest oocyte of their ovaries and the relative expression level of Vg gene in their head were detected. Data in the figure are mean±SE. Different letters above bars indicate significant differences (P<0.05, Fisher’s LSD test). The same for Fig. 5.

2.3 CO2麻醉次数对中华蜜蜂处女蜂王卵巢发育的影响

为了探索CO2麻醉次数对中华蜜蜂处女蜂王卵巢发育的影响，我们在保持CO2浓度一致(75%)的条件下，改变了CO2的麻醉次数，同样在蜂王10日龄时检测卵巢的发育水平。不同次数CO2麻醉后10日龄蜂王卵巢重差异如图5(B)所示，CO2麻醉均能促进蜂王卵巢的发育，其中麻醉2次的作用效果最佳，其次分别是麻醉1次和3次，均大于对照组，其中CO2麻醉2次后蜂王的卵巢重显著高于其他处理组以及对照组(P<0.05)。

蜂王卵巢与卵巢细胞形态如图5(A)所示，CO2麻醉后蜂王卵巢的外部形态均大于对照组。通过测定10日龄蜂王卵巢中最大卵母细胞的长度发现，CO2麻醉2次后蜂王卵巢中最大卵母细胞的长度最大，其次分别是麻醉1次和3次的，其中CO2麻醉2次后最大卵母细胞长度显著大于其他处理组以及对照组(P<0.05)(图5: C)。

qPCR结果(图5: D)表明，CO2麻醉2次后10日龄蜂王头部中Vg基因的相对表达量最高，其次分别是麻醉1次和3次的，均高于对照组，CO2麻醉2次后蜂王头部Vg基因的相对表达量显著高于其他处理组以及对照组(P<0.05)。

图5 CO2麻醉次数对中华蜜蜂处女蜂王卵巢发育的影响Fig.5 Effect of treatment frequency of CO2 narcosis on the ovarian development of virgin queens of Apis cerana ceranaA: 蜂王卵巢的HE染色后形态观察Morphological observation of queen ovary after HE staining; B: 蜂王卵巢重Ovarian weight of queen; C: 蜂王卵巢最大卵母细胞长度Length of the largest oocyte of queen ovary; D: 蜂王头部中Vg基因相对表达量Relative expression of Vg gene in queen head. 处理组中处女蜂王用75% CO2进行麻醉处理，麻醉时间8 min，CO2麻醉次数分别设定为1次(5日龄时麻醉1次)、2次(蜂王5和6日龄时各麻醉1次)与3次(蜂王5, 6与7日龄时各麻醉1次)；并设定一个未经麻醉处理的对照组(CK)。待蜂王发育至10日龄时，分别测定各组蜂王的卵巢重、最大卵母细胞长度以及头部Vg基因的相对表达量。The virgin queens in treatment groups were narcotized with 75% CO2 for 8 min, and the treatment frequencies of CO2 narcosis were set as once (at the 5-d-old), twice (at the 5- and 6-d-old, respectively) and thrice (at the 5-, 6- and 7-d-old, respectively). The virgin queens not subjected to CO2 narcosis were used as the control group (CK). The ovarian weight, length of the largest oocyte of ovary and the relative expression level of Vg gene in the head of the 10-d-old queens in various groups were detected.

3 讨论与结论

蜂王生殖发育是一个渐变的过程，卵巢发育在幼虫时期就已经开始(Lagoetal., 2016)。蜂王羽化后，卵巢的形态以及卵巢管中细胞的分布发生着明显的变化(Patrício and Cruz-Landim, 2002)。本研究以蜂王的体重、卵巢重、卵巢管数目、卵巢管细胞分布以及受精囊直径作为蜂王生殖发育水平的衡定指标(Woyke, 1971; Nioetal., 2013)，系统研究了蜂王生殖系统随着日龄发生的动态变化。结果表明，蜂王羽化后体重有一个下降的过程，之后将回升部分并趋于一个相对稳定的状态(图3: A)，体重的下降可能是蜂王羽化后需排出变态发育过程产生的代谢废物，或面临新的生存环境需要一个适应过程，之后的回升可能是蜂王适应新的生存环境并趋于发育稳定的状态。蜂王卵巢重在0-6日龄相对稳定，6-12日龄卵巢重明显上升，之后趋于稳定(图3: B)，表明6-12日龄是中华蜜蜂蜂王卵巢发育的关键时期。卵巢发育的同时，卵巢管形态以及细胞分布也发生了深刻变化。发育过程中，卵巢管生长区不断伸长，而原卵区与端丝区明显缩短(图1: J-R)，最终卵巢管将形成由短而细的端丝区、原卵区以及较长的生长区组成的相对稳定结构(图2)；受精囊直径不会随着蜂王日龄发生明显的波动(图3: C)；蜂王卵巢管数目变化与蜂王日龄的增加无明显关系(图3: D)。研究表明，蜜蜂的级型分化发生在幼虫时期，工蜂幼虫时期营养不足，大量的程序性细胞死亡导致工蜂95%～99%卵巢管原基退化，而蜂王幼虫营养充足，体内较高的保幼激素(juvenile hormone, JH)滴度保护了卵巢免受这一退化(Kucharskietal., 2008; Kamakura, 2011; Lagoetal., 2016)。因此，卵巢管数目可能与幼虫时期的营养条件或种性相关，与羽化后日龄变化无关。

CO2麻醉通常用于人工授精过程中麻醉蜂王(Mackensen, 1947; Libertietal., 2019)，也可用于处女蜂王的麻醉，诱导处女蜂王产下未受精卵(Engels and Ramamurty, 1976; Kaftanoglu and Peng, 1982)。CO2不仅能够麻醉蜂王，还能通过加速生殖细胞的发育与刺激卵巢管生长区的初始分化来触发产卵(Bergeretal., 2005)。研究表明，西方蜜蜂处女蜂王经CO2麻醉后，头部基因的表达变化与交尾后蜂王头部基因表达变化相似，这些变化可能与蜂王卵巢的激活相关(Nioetal., 2011; Vergozetal., 2012; Manfredinietal., 2015)。本研究分析了不同CO2麻醉条件对中华蜜蜂处女蜂王卵巢发育的影响，为最适CO2麻醉条件的选择提供了参考。结果表明，50%, 75%以及90% 3个不同浓度CO2麻醉均能促进卵巢的发育。其中75% CO2麻醉后蜂王卵巢重最大，头部Vg基因的表达量最高(图4)，表明75% CO2浓度对蜂王的生殖发育具有一个较好的促进作用。此外，我们保持了CO2浓度一致，改变了CO2麻醉次数，结果表明，不同次数CO2麻醉均能促进蜂王卵巢的发育。其中CO2麻醉2次后蜂王头部的Vg基因表达量最高，卵巢重以及最大卵母细胞的长度均表现为最大(图5)，表明CO2麻醉2次对卵巢发育的促进效果相对更好。因此，在利用CO2麻醉技术诱导蜂王产卵时，应选择相对温和的CO2麻醉条件，CO2浓度过高或者麻醉次数过多可能会对蜂王的生殖生理产生一些负面影响(Es′kov, 2015)。

卵黄原蛋白(Vg)是蜜蜂卵黄发生的重要前体物质，主要在脂肪体中合成并分泌至血淋巴，卵黄发生时卵黄原蛋白会转运至卵巢被卵母细胞所摄取，最终将转化为卵黄蛋白(vitellin, Vt)作为胚胎发育的营养物质(Pintoetal., 2000)，其表达水平与卵巢的发育密切相关(Engels, 1974; Koywiwattrakuletal., 2005; 史晶亮等, 2019)。同时，有研究表明蜂王头部Vg基因的表达量会随着日龄的增加而升高(Coronaetal., 2007)。本研究选取蜂王头部Vg基因的相对表达量作为衡定蜂王生殖发育水平的指标。结果表明，不同条件CO2麻醉均能上调蜂王头部Vg基因的表达(图4: D和图5: D);同时，CO2麻醉后，蜂王卵巢中卵母细胞出现了更多的卵黄颗粒沉积(图4: A和图5: A)。我们推测，CO2麻醉对蜂王卵巢发育的促进作用可能与卵黄原蛋白的合成与转化紧密相关。

综上所述，中华蜜蜂蜂王羽化后卵巢会发生明显的发育变化，而CO2麻醉能加速卵巢的发育，其中CO2浓度为75%，麻醉次数2次对蜂王卵巢发育的促进效果较为显著。研究结果对最适CO2麻醉条件的选择具有参考意义。然而，目前的研究结果还不足以阐明CO2麻醉对蜂王卵巢激活的作用机制，不能提供一个将CO2麻醉与蜂王卵巢激活直接联系起来的分子机制。这些问题有待于进一步探索和研究。