褐飞虱Nl15基因的克隆及功能分析

王福鑫, 王渭霞, 魏 琪, 何佳春, 赖凤香, 傅 强, 万品俊

(中国水稻研究所, 水稻生物学国家重点实验室, 杭州 310006)

褐飞虱Nilaparvatalugens属半翅目(Hemiptera)飞虱科(Delphacidae)，通过刺吸式口器吸食水稻韧皮部汁液和传播水稻病毒侵害水稻危害水稻，严重时被害水稻颗粒无收。我国自20世纪80年代以来，褐飞虱发生面积约占水稻种植面积的50%，年均损失稻谷仍达10～15亿kg(郭予元, 2015)。 目前，化学防治仍是控制褐飞虱为害的主要手段，然而不合理地使用化学农药导致害虫抗性产生，引起褐飞虱再猖獗，同时造成严重的环境污染(吴孔明, 2018)。

利用水稻自身抗性是有效、经济、安全地防治褐飞虱的措施(任西明等, 2017)。自1967年国际水稻研究所(International Rice Research Institute, IRRI)率先报道了抗褐飞虱的水稻资源后，含Bph1,bph2,Bph3和bph4等基因的抗性水稻品种先后在我国和东南亚等地大面积应用(Pathaketal., 1969; Athwaletal., 1971; Liuetal., 2015; Sogawa, 2015)。然而，在20世纪70年代，水稻IR26(含Bph1)和IR36(含bph2)等抗虫品种在推广2～8年后，褐飞虱对水稻品种的致害性发生明显的变化，形成不同的褐飞虱生物型或种群(如Mudgo、ASD7种群等)，使原本抗虫的水稻品种变为感虫，水稻品种抗性“丧失”(Varca and Feuer, 1976; Gallagheretal., 1994)。近年来，在我国云南等部分地区，由于褐飞虱致害性的变化，含Bph3 基因的Rathu Heenati水稻品种也存在对褐飞虱抗性丧失的风险(黄所生等, 2014; 李波等, 2019)。在室内，胁迫饲养褐飞虱田间种群可以形成褐飞虱IR56种群，该种群可致害含Bph3的IR56水稻品种(郑瑜等, 2016)。然而，新的褐飞虱种群形成及其与水稻抗虫基因的关系，特别是两者间的分子机制尚属空白。在水稻中，凝集素受体激酶(lectin receptor kinase, LecRK)和核苷酸结合位点-富含亮氨酸的重复序列(nucleotide-binding site and leucine-rich-repeat, NBS-LRR)分别感受来自褐飞虱释放的植食性昆虫相关分子模式(herbivore-associated molecular pattern, HAMP)和效应子(effector)信号，形成自身的第一层防御系统模式触发免疫(pattern-triggered immunity, PTI)和第二层防御系统效应子触发免疫(effector-triggered immunity, ETI)(杜波等, 2016)。相对应地，褐飞虱通过唾液效应子或肠道蛋白、微生物来适应(或对抗)植物的抗虫防御反应(Petrova and Smith, 2014; Pengetal., 2017; Haoetal., 2018; Shangguanetal., 2018; Jietal., 2021; Liuetal., 2021)。近年来，褐飞虱唾液效应子和激发子的鉴定取得重要进展。研究人员通过高通量测序、蛋白组学等技术，在不同褐飞虱种群(TN1, Mudgo, ASD7, YHY15和Leersia种群)中鉴定出近千个唾液蛋白基因及其编码蛋白(Jietal., 2013; Liuetal., 2016; Huangetal., 2018; Raoetal., 2019)。其中，褐飞虱TN1种群中的Catalase(Petrova and Smith, 2014)、NlMLP(Shangguanetal., 2018)、NlSP1 (Huangetal., 2020)和NlugOBP11 (Liuetal., 2021)以及Mudgo种群中的NlEG1 (Jietal., 2017)和NlSEF1(Yeetal., 2017) 6个唾液蛋白基因的功能取得突破性进展。与之相比，尚未见褐飞虱IR56种群中唾液蛋白基因克隆和功能的研究。我们前期构建了褐飞虱TN1种群和IR56种群的头部转录组数据，通过生物信息学筛选出2 563个差异表达基因，从中挖掘出一个功能未知基因Nl15(在IR56种群中的相对表达量是TN1种群中的5倍)。本研究以褐飞虱TN1种群和IR56种群为主要研究对象，通过基因克隆、时空表达谱、RNAi和生物学测定，探究Nl15在褐飞虱IR56等致害性种群中的功能，为解析褐飞虱与水稻防御与反防御互作的分子机制以及阐明褐飞虱克服水稻抗性的机理提供参考。

1 材料与方法

1.1 供试昆虫与水稻

供试褐飞虱为室内饲养的TN1种群和IR56种群(源自2010年在杭州富阳田间采集的种群，中国水稻研究所)，在感虫TN1水稻和抗虫IR56水稻上连续饲养所得，饲养条件为温度28℃±1℃，相对湿度80%±10%，光周期14L∶10D。2个褐飞虱种群的所有龄期样本为3个生物学重复，每个重复的样品数目为：卵100粒、1-5龄若虫20头、雌雄成虫(初羽化后48 h内)各10头；解剖镜下分离150头短翅型雌成虫(初羽化48 h内)用于解剖头、胸、腹和足，以上样品置于1.5 mL的Eppendorf管中经液氮处理后，-80℃冰箱保存，用于总RNA提取。

1.2 总RNA 提取与cDNA 的合成

将1.1节各发育阶段褐飞虱(卵质量或虫质量为8 mg)及雌成虫头、胸、腹和足(各组织鲜质量约2 mg)，每组织重复取样3次，利用Trizol法(Invitrogen，美国)提取总RNA，通过微量紫外分光光度仪(NanoDrop 2000，美国)和1%琼脂糖凝胶电泳检测其浓度和质量。采用ReverTra Ace qPCR RT Kit(东洋纺生物科技有限公司，上海)试剂盒的步骤合成cDNA第1链。

1.3 基因克隆与序列分析

基于褐飞虱IR56种群头部转录组序列(本实验室构建且尚未发表)，检索到1个转录本Nl15[基因表达量FPKM(fragments per kilobase per million mapped fragments)≥10.1]，并利用Primer Premier 5.0设计目的基因的扩增引物(表1)。以褐飞虱IR56种群的不同龄期cDNA混合并作为模板，利用LA Taq聚合酶(TaKaRa，大连)进行PCR扩增。PCR反应体系： LA Taq (5 U/μL) 0.12 μL, 10×PCR缓冲液2.5 μL, dNTP Mix(2.5 mmol/L)2.0 μL, 上下游引物(10 μmol/L)各1 μL, cDNA 模板(500 ng/μL)1 μL, ddH2O 17.38 μL。PCR反应程序： 94℃ 3 min; 94℃ 30 s, 55℃ 30 s, 72℃ 1.5 min, 35次循环; 72℃ 10 min。扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测，通过DNA回收试剂盒(Promega，美国)纯化，连接于pEASY-T3载体(全式金生物技术有限公司，北京)，导入pEAST-T1感受态细胞(全式金生物技术有限公司)，随机挑选4个阳性克隆子送杭州尚亚生物科技有限公司测序。

对测序正确的阳性克隆子进行生物信息学分析，利用BioEdit(v7.0.5.3)进行序列比对和拼接；利用NCBI 的Blastx 工具(http:∥blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)进行同源基因搜索；利用在线工具ORF Finder (https:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder)预测开放阅读框(open reading frame, ORF)及蛋白质翻译情况；利用Computer pI/Mw工具(http:∥web.expasy.org/compute_pi)预测氨基酸的理论等电点和分子量；利用在线工具SignalP 5.0(http:∥www.cbs.dtu.dk/services/SignalP)分析N末端信号肽序列;利用TMHMM 2.0(http:∥www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM)预测跨膜结构域；利用NetNGlyc 1.0 (http:∥www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc)预测糖基化位点；利用SMART(http:∥smart.embl.de)预测结构功能域。

表1 引物信息Table 1 Primer information

1.4 qPCR检测Nl15的表达模式

根据1.3节克隆的褐飞虱Nl15序列设计引物(表1)，以NlActin和NlRPS15为内参基因(引物序列见表1)，以1.2节合成的褐飞虱TN1和IR56种群各发育阶段和雌成虫不同组织的cDNA为模板，进行qPCR。PCR反应体系(25 μL): SYBR Green Realtime PCR Master Mix(东洋纺生物科技有限公司, 日本)12.5 μL, 上下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL, cDNA模板2 μL, ddH2O 9.5 μL。反应程序: 95℃ 1 min; 95℃ 15 s, 60℃ 15 s, 40次循环。qPCR均满足的最低要求试验信息量(MIQE)标准(Bustinetal., 2009)，每样品重复测定3次。

1.5 Nl15的RNAi

根据1.3节克隆的褐飞虱Nl15和GFP序列设计dsRNA引物(表1)。 参考MEGAscript RNAi(Ambion, 美国)试剂盒说明书合成dsRNA，dsRNA的质量和浓度检测同1.2节。

参考Wan等(2019)的方法，选取褐飞虱TN1和IR56种群4龄若虫，在其胸部节间膜显微注射50 ng(约60 nL)Nl15的dsRNA(以注射等量dsGFP为对照组)。注射后置于IR56水稻(出芽30 d后)，于1 d后，剔除死亡的褐飞虱，开始逐日观察(持续8 d)试虫的死亡数和存活数。共设置12个重复，每个重复40头试虫。其中，3个重复用于生物学测定，9个重复(每个重复5头若虫)用于注射后3 d靶基因Nl15表达量检测，qPCR同1.4节。待试虫羽化后，采用“Parafilm sachet”法(Pathaketal., 1982)测定蜜露量；参考郑瑜等(2016)的方法收取初羽化1 d内的雌成虫，逐头称量试虫体重，置于石蜡小袋中(1头/袋)并固定在IR56水稻(60 d苗龄)叶鞘并在该处标记，1 d后测定每头雌成虫的体质量增量。每个处理至少测定25个个体。

在褐飞虱4龄若虫中注射dsRNA后连续取食IR56水稻植株3 d，收取整株水稻的叶鞘提取总RNA，方法同1.2节;检测水稻中防御相关基因OsLecRK4(GenBank登录号: KF748981),OsMPK10(GenBank登录号: NP_001385207.1),OsWRKY24(GenBank登录号: AY676925.1),OsLox(GenBank登录号: OSU72251),OsNPR1(GenBank登录号: GU722160.1)和OsGns5(GenBank登录号: AAD10382.1)的表达量，qPCR同1.4节。内参基因OsActin和OsUbiquitin(OsUbq)的引物均引自参考文献(表1)。

1.6 数据分析

基因表达量数据以平均值±标准误表示，采用Shapiro-Wilk和Levene方法检验数据的正态分布性和方差齐性，两组间比较采用Student氏t检验，多组间比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，事后检验采用Tukey氏法。采用Kaplan-Meier法计算存活率，并采用Log-rank检验进行生存比较。基因相对表达量采用2-ΔΔCT法分析(Livak and Schmittgen, 2001)。用R 软件包(tidyverse v1.3.1, rstatix v0.7.0, magricolae v1.3.5, survival v3.2.11, survminer v0.4.9和ggplot2 v3.3.4)完成数据清洗、变换、统计分析与绘图。

2 结果

2.1 褐飞虱Nl15基因序列

PCR扩增获得褐飞虱Nl15 cDNA(GenBank登录号: OK181113)，长1 353 bp，符合预期长度，与转录组中的Nl15序列一致，由此证明转录组序列的正确性。推导的Nl15编码蛋白质序列包含335个氨基酸。双序列比对结果表明，Nl15与褐飞虱参考基因组(GenBank登录号: GCF_014356525.1)中同源基因编码的氨基酸序列(GenBank登录号: XP_039291559)一致性达79%，与灰飞虱Laodelphaxstriatellus同源蛋白hypothetical protein(GenBank登录号: RZF48609.1)的氨基酸序列一致性达45%，除此之外，未搜索到其他物种的同源基因。ORF Finder分析表明，Nl15包含1个长度为1 008 bp的ORF，5′UTR和3′UTR长度分别为195和150 bp，预测的分子质量为38.7 kD，理论等电点为7.54；Nl15蛋白的N端包含长度为23个氨基酸残基的信号肽，不含跨膜结构域及其他已知的功能结构域；第152位的天冬酰氨酸残基是N-连接糖基化位点。

2.2 Nl15基因在两个褐飞虱种群中的时空表达谱

qPCR结果表明(图1)，Nl15基因在褐飞虱TN1种群和IR56种群中的龄期和组织的表达模式相似，在3-4龄若虫中的相对表达量最高，显著高于卵期、1-2龄若虫和雌成虫的(P<0.001)。在褐飞虱雌成虫头部中的相对表达量显著高于在胸部、腹部和足中的(P<0.05)，并且在IR56种群头部中Nl15的相对表达量显著高于在TN1种群头部中的(P<0.05)(数据未展示)。

图1 Nl15基因在褐飞虱TN1(A, B)和IR56(C, D) 种群不同发育时期(A, C)和雌成虫不同组织(B, D)的表达模式Fig. 1 Expression profiles of Nl15 in different developmental stages (A, C) and female adult tissues (B, D) of TN1 (A, B) and IR56 (C, D) populations of Nilaparvata lugensE: 卵Egg; N1-5: 分别为1-5龄若虫1st-5th instar nymphs, respectively; FA: 雌成虫Female adult; MA: 雄成虫Male adult.图中数据为平均值±标准误；柱上不同字母表示基因表达量在不同发育阶段或不同组织间差异显著(P<0.05, 单因素方差分析和Tukey氏HSD多重比较)。Data in the figure are mean±SE. Different letters above bars indicate significant difference in the gene expression level among different developmental stages and tissues (P<0.05, one-way ANOVA followed by Tukey’s HSD test).

2.3 RNAi对褐飞虱Nl15表达量和生物学性状的影响

在褐飞虱TN1种群中，显微注射dsNl15 3 d后，处理组(dsNl15注射组)中Nl15基因的相对表达量(0.18±0.04)显著低于对照组(dsGFP注射组, 0.43±0.02)(F1,16=71.4,P<0.001)；在褐飞虱IR56种群中，注射dsNl15 3 d后，与注射dsGFP的对照组(0.15±0.01)相比，处理组Nl15基因的相对表达量(1.04±0.11)显著降低了85.9%(F1,16=38.98,P<0.001)(图2: A)。

图2 褐飞虱TN1和IR56种群4龄若虫显微注射dsRNA后若虫中Nl15的表达量(A)、存活率(B)以及成虫蜜露量(C)和体质量增量(D)Fig. 2 Expression level of Nl15 (A) in nymphs, the survival rate (B), and the honeydew amount (C) and body weight gain (D) of adults of TN1 and IR56 populations of Nilaparvata lugens after microinjecting dsRNA into the 4th instar nymphs以dsGFP为对照组。A, C和D图中数据为平均值±标准误；柱上不同字母表示基因表达量经Tukey氏HSD检验差异显著(P<0.05)。B图中数据采用Kaplan-Meier法计算，并采用Log-rank检验进行比较。dsGFP injection group was used as the control group. Data in Figs. A, C, and D are mean±SE. Different letters above bars indicate significant differences (P<0.05) in the gene expression level analyzed by Tukey’s HSD test. Data in Fig. B were calculated by the Kaplan-Meier method and compared by the Log-rank test.

存活率曲线表明，显微注射dsNl15和dsGFP后褐飞虱TN1种群的中位存活时间为9 d，显微注射dsGFP后IR56种群未明显死亡(死亡率仅为4.44%)，上述3个处理间的存活时间无显著差异(P>0.05)(图2: B)。显微注射dsGFP后的IR56种群成虫蜜露量最高(10.72±0.93 mg)，显著高于显微注射dsNl15的(3.13±0.32 mg)(P<0.05)，后者与显微注射dsNl15(1.09±0.06 mg)和dsGFP(1.71±0.33 mg)的TN1种群蜜露量间均无显著差异(图2: C)。显微注射dsGFP后IR56种群成虫体质量增量(0.59±0.05 mg/头)显著高于显微注射dsNl15的(0.33±0.03 mg/头)(P<0.05)，前两者的体质量增量显著高于显微注射dsNl15(0.02±0.02 mg/头)和dsGFP(0.03±0.05 mg/头)的TN1种群的(P<0.05)(图2: D)。

2.4 褐飞虱Nl15的RNAi对水稻中防御相关基因表达量的影响

qPCR检测结果表明，与注射dsGFP的褐飞虱TN1种群相比，注射dsNl15的褐飞虱TN1种群在IR56水稻植株上连续取食3 d后，5个水稻防御相关基因(OsLecRK4,OsWRKY24,OsLox，OsNPR1和OsGns5)的相对表达量未发生显著变化(P>0.05)，而OsMPK10的相对表达量(t=-2.64,P<0.05)显著上调(图3: A)。Nl15被RNAi后的褐飞虱IR56种群4龄若虫在IR56水稻上连续取食3 d后，6个水稻防御相关基因的相对表达量均发生显著变化(OsLecRK4:t=-3.89,P<0.01;OsWRKY24:t=-2.43,P<0.05;OsMPK10:t=-2.37,P<0.05;OsNPR1:t=-4.17,P<0.01;OsLox:t=-3.49,P<0.01;OsGns5:t=-2.84,P<0.05)，与注射dsGFP的对照组相比，分别显著提高了39.92%, 28.71%, 29.31%, 32.24%, 28.30%和28.66%(图3: B)。

图3 褐飞虱TN1(A)和IR56(B)种群4龄若虫显微注射dsRNA后取食3 d对IR56水稻植株中防御相关基因表达量的影响Fig. 3 Effects of microinjection of dsRNA into the 4th instar nymphs of the TN1 (A) and IR56 (B) populations of Nilaparvata lugens on the expression levels of defense-related genes in IR56 rice plants fed for 3 d图中数据为平均值±标准误；柱上星号、双星号和ns分别代表与对照组差异显著(P<0.05)、极显著(P<0.01)和不显著(P>0.05)(T检验)。Data in the figure are mean±SE. Asterisk, double asterisk and ns above bars indicate significant difference (P<0.05), extremely significant difference (P<0.01) and no significant difference (P>0.05), respectively, from the control group by T-test.

3 讨论

本研究克隆了一个褐飞虱功能未知的基因Nl15，其编码的氨基酸序列具有23个氨基酸的信号肽，无跨膜结构域。分析发现，Nl15在Ji等(2013)、Liu等(2016)和Rao等(2019)报道的褐飞虱TN1, Mudgo, ASD7, YHY15和Leersia种群的唾液腺转录组中均表达(0.47

本研究通过同源分析发现，Nl15与灰飞虱同源蛋白hypothetical protein(GenBank登录号: RZF48609.1)的氨基酸序列一致性最高(45%)，没有找到高度同源的其他物种的氨基酸序列，推测Nl15可能是快速进化基因。在植物与病虫害协同进化过程中，基因的快速进化(正向选择)使效应子产生基因家族膨胀和物种特异性，导致难以通过同源搜索发现其他生物中的同源物(Boulainetal., 2018)。比如，在蚜虫中，C002,Mp1和Mp2等唾液分泌蛋白基因是一类快速进化基因，因其序列变异程度高，在其他生物中未发现同源基因(Pitino and Hogenhout, 2013)。 在3种瘿蚊(Mayetioladestructor,Mayetiolahordei和Mayetiolaavenae)中，也存在因正向选择产生的数十个物种特有的效应子基因(Al-Jboryetal., 2018)。

本研究通过RNAi研究了Nl15在褐飞虱IR56种群的生物学功能，从研究结果来看，RNAi后IR56种群的存活率以及成虫蜜露量和体质量增量均显著降低(图2)。存活率、蜜露量和体质量增量是评价褐飞虱种群致害性的重要指标，比如，非致害的褐飞虱TN1种群在抗虫IR56水稻上的这些指标显著低于致害的褐飞虱IR56种群的(郑瑜等, 2016)。本研究结果表明，干扰Nl15基因的表达有效地降低了褐飞虱IR56种群的致害性指标。对水稻防御信号基因的表达分析发现，褐飞虱IR56种群取食水稻均可显著诱导水稻防御相关基因OsLecRK4,OsMPK10,OsWRKY24，OsNPR1,OsLox和OsGns5基因的表达量显著上调(图3)。与之类似，Nanda等(2018)发现，褐飞虱TN1种群取食后显著提高了水稻中OsLecRK3/4,OsMPK3/5/7/10/12/13/14/16,OsNPR1和OsLox的相对表达量。其中，OsLecRK基因(OsLecRK1/2/3/4)是Liu等(2015)通过图位克隆得到的Bph3基因，该基因是串联排布并定位于细胞膜的基因簇。Bph3与2个褐飞虱种群(TN1种群和IR56种群)间的互作涉及多个反应。Nanda等(2018)推测，褐飞虱TN1种群取食含Bph3的IR56水稻过程中，HAMP或激发子和质外体效应子，激发水稻模式识别受体OsLecRKs，进一步激活MAPK级联反应，触发第一层防御系统PTI，提高水杨酸、乙烯、次级代谢产物(如木质素、植保素等)含量，促进水稻的抗虫反应；而在褐飞虱IR56种群取食过程中，其可能分泌质外体或细胞质效应子阻止PTI，产生效应子激发的感病性(effector-triggered susceptibility, ETS)。此外，褐飞虱也可能分泌效应子激发水稻的第二层防御反应ETI。然而，褐飞虱唾液蛋白对应的水稻ETI途径尚不清楚。本研究发现，干扰Nl15的褐飞虱IR56种群能够激发水稻OsLecRK4等PTI通路防御基因的相对表达量。因此，褐飞虱IR56种群中的Nl15可能参与水稻ETS反应。然而，Nl15是否作为效应子分泌至水稻叶鞘中，其下游的ETS分子网络，仍需通过Western blot和酵母双杂交等实验进一步验证。另外，水稻ETS与PTI或ETI的分子关系也需进一步研究。

干扰Nl15后，褐飞虱IR56种群取食显著诱导IR56水稻中JA信号通路相关基因OsLox的相对表达量。Zhou等(2014)推断JA不参与或负调控水稻对褐飞虱的抗性。然而，Zhao等(2019)和Xu等(2021)报道了褐飞虱取食激发JA信号途径，并推断JA信号正向调控水稻对褐飞虱的抗性，这与本研究的结果相一致。植物的抗性通路是极其复杂分子网络，存在多种激素及近千种次级代谢产物，它们在抗性反应中并不相互独立，而是存在相互作用；同样，褐飞虱释放的HAMP和效应子种类多、特异性高，在不同褐飞虱种群的组成也可能不同，这使得褐飞虱唾液蛋白与水稻抗虫分子物质的互作更为复杂，仍需开展大量的研究，进而解析水稻对褐飞虱的抗性及褐飞虱对水稻的致害性。