响应面法在红花国槐‘姹紫1号’增殖培养基优化中的应用1)

付茵茵 李长贵 周继磊

(山东省林木遗传改良重点实验室(山东省林业科学研究院)，济南，250014)(山东省林业保护和发展服务中心)

王雅慧 张元莉

(山东省林木遗传改良重点实验室(山东省林业科学研究院))(山东祥辰生态技术研究院有限公司)

安连任 夏阳 庞彩红 李双云

(山东省蒙阴县综合行政执法局)(山东省林木遗传改良重点实验室(山东省林业科学研究院))

槐树(SophorajapanicaL.)，又名国槐、家槐、中国槐，属蝶形花亚科、槐属[1-2]。树形高大，是集药用、材用和观赏绿化等多用途于一体的人文乡土树种[3]。红花国槐‘姹紫1号’是山东省林业科学研究院从古树中选育出的新品种，并于2016年获得植物新品种权证书。其母株为山东省潍坊市诸城市马庄镇闸河崖村古槐，树龄500 a；旗瓣中间黄色，周边为白色，翼瓣和龙骨瓣颜色为深粉晕(英国皇家园林协会RHS植物比色卡号为63B)，花色艳丽、花期长，弥补了夏季开花乔木稀少的缺憾；具有较高的观赏价值。‘姹紫1号’耐干旱瘠薄、耐盐碱，满足当前市场的需求，适宜在我国北方地区推广应用。

新品种培育成功之后，其推广栽培速度取决于能否快速繁殖苗木。新品种繁育一般采用嫁接、扦插、组培等方法。由于新品种来源于古树，受古树生长状况影响，可采集的穗条数量有限，短期内很难大量快速繁殖。鉴于上述原因，新品种采用组织培养方式进行育苗。国槐基因组庞大，虽然组培方面已有相关研究[4-7]，但由于不同品种之间基因型的差异导致快繁体系不同，因此有必要针对特异优良品种建立相应的组培快繁技术体系。前期，山东省林业科学研究院已经建立‘姹紫1号’无菌苗体系，初步诱导出不定芽，但是不定芽增殖率低、茎叶节间短、苗高生长量小。为此，本研究以红花国槐‘姹紫1号’组培苗为试验材料，以6-苄氨基嘌呤(6-BA)、萘乙酸(NAA)、吲哚丁酸(IBA)为植物生长调节剂，采用单因素试验、响应面分析法，分析不同质量浓度组合的6-苄氨基嘌呤、萘乙酸、吲哚丁酸对‘姹紫1号’增殖培养基的不定芽增殖率、组培苗苗高增长量的影响，从不同质量浓度的6-苄氨基嘌呤、萘乙酸、吲哚丁酸组合中确定最优的红花国槐增殖培养基，旨在为红花国槐的低成本高效产业化繁育提供参考。

1 材料与方法

材料与试剂：组培苗由山东省林业科学研究院提供。植物生长调节剂——萘乙酸(NAA)，购于北京博奥拓达科技有限公司；吲哚丁酸(IBA)，购于中国医药上海化学试剂公司；6-苄氨基嘌呤(6-BA)，购于上海稼丰园艺用品有限公司；MS培养基、琼脂、蔗糖等。

培养方法与条件：在无菌条件下，将经诱导形成的生长一致的国槐不定芽接种到配置的增殖培养基中。设置6-苄氨基嘌呤、萘乙酸、吲哚丁酸各3个质量浓度。每个处理组均含MS培养基+质量浓度为30.0 g/L的蔗糖+质量浓度为6.0 g/L的琼脂+不同质量浓度的6-苄氨基嘌呤、萘乙酸、吲哚丁酸，pH=5.8～6.0，每个处理设置10个重复，每瓶接种3簇。组培室条件——昼温度(25±2)℃，夜温度(18±2)℃；光照强度2 500～3 000 lx，光照时间14～16 h。

单因素试验设计：设置6-苄氨基嘌呤质量浓度分别为0.75、1.00、1.25、1.50、1.75、2.00、2.25、2.50、2.75 mg/L；萘乙酸质量浓度分别为0.25、0.50、0.75、1.00、1.25、1.50 mg/L；吲哚丁酸质量浓度分别为0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0 mg/L；进行预试验，分析6-苄氨基嘌呤、萘乙酸、吲哚丁酸质量浓度对国槐不定芽增殖率的影响。经遴选确定6-苄氨基嘌呤、萘乙酸、吲哚丁酸质量浓度分别为2.00、1.00、0.25 mg/L。

响应面试验设计：在单因素试验结果的基础上，确定了6-苄氨基嘌呤、萘乙酸、吲哚丁酸的适宜范围。但由于各植物生长调节剂之间可能存在交互作用，故本研究依据Box-Behnken试验设计原理，以不定芽增殖率、苗高增长量为评价指标，设计多因素正交旋转组合试验(见表1)，遴选最优的红花国槐增殖培养基。

不定芽增殖率=(接种后不定芽数量/接种前不定芽数量)×100%；

苗高增长量=接种后苗高(H1)-接种前苗高(H0)。

表1 响应面试验设计的植物生长调节剂质量浓度与梯度

数据处理：采用excel进行数据整理，运用spss 24.0进行单因素试验的数据处理，采用最小显著差数法进行不同处理间均值的显著性差异比较，采用Design Expert 10进行响应面分析。

2 结果与分析

2.1 不同6-苄氨基嘌呤质量浓度对不定芽增殖率的影响

将生长一致的国槐不定芽，接入附加有不同6-苄氨基嘌呤质量浓度的MS培养基上，分别统计不定芽的增殖率和苗高增长量(见表2)。由表2可见：不同6-苄氨基嘌呤质量浓度对芽的增殖率影响很大，芽的增殖率随着激素质量浓度的增加而提高，在激素质量浓度为2.0 mg/L时，达到最大值447%；随着激素质量浓度的进一步增加，芽的增殖率开始下降，且产生的芽表现为小叶片萎缩，不能正常伸展，玻璃化现象明显，形态不正常。另外，苗高增长量也在激素质量浓度为2.0 mg/L时达到最大；说明6-苄氨基嘌呤质量浓度为2.0 mg/L左右时，最有利于国槐芽的增殖。

2.2 不同萘乙酸质量浓度对不定芽增殖率的影响

将生长一致的国槐不定芽，接入附加有不同萘乙酸质量浓度的MS培养基培养后，分别统计不定芽的增殖率和苗高增长量(见表3)。由表3可见：芽的增殖率随萘乙酸质量浓度的增加呈现出先增加后降低的趋势。萘乙酸质量浓度为0.5 mg/L时，芽的增殖率达到最大值428.5%。随着萘乙酸质量浓度的进一步提高，芽的增殖率开始下降。在试验中观察到，创伤处均形成近半圆球状，外层松散、内层硬实的愈伤组织团；随后，这些愈伤组织团块颜色加深，为灰绿色，硬实度增加。原因是萘乙酸有利于将国槐诱导为愈伤组织，进而转化为芽。因此，诱导丛生芽时，萘乙酸适宜的质量浓度为0.50 mg/L左右。

表2 不同6-苄氨基嘌呤质量浓度时的组培增殖率和苗高增长量

表3 不同萘乙酸质量浓度时的组培增殖率和苗高增长量

2.3 不同吲哚丁酸质量浓度对不定芽增殖率的影响

细胞分裂素与生长素适宜的浓度配比是诱导不定芽增殖的关键；将生长一致的不定芽，转接在附加有不同吲哚丁酸质量浓度的MS培养基上培养后，分别统计不定芽的增殖率、苗高增长量(见表4)。由表4可见：芽的增殖率随吲哚丁酸质量浓度的增加呈现出先增加后降低的趋势；当吲哚丁酸质量浓度为0时，芽增殖率为212%；吲哚丁酸质量浓度为0.5 mg/L时，芽的增殖率最高，达到461%；随着吲哚丁酸质量浓度的进一步提高，芽的增殖率开始下降，下降到一定的值后趋于平缓。由本试验可看出，虽吲哚丁酸对诱导国槐增殖丛生芽不是必需的，但加入低质量浓度的吲哚丁酸，可以提高芽的分化率；所以，吲哚丁酸在和6-苄氨基嘌呤配合使用时，吲哚丁酸诱导国槐增殖的适宜质量浓度为0.5 mg/L左右。

2.4 3种植物生长调节剂的不同组合对不定芽增殖率和苗高增长量的影响

根据正交旋转试验设计进行试验(见表5)，根据表5的试验数据，通过Design-Expert 8.06软件进行多元回归拟合，以不定芽增殖率(Ir)、苗高增长量(H)为评价指标，以6-苄氨基嘌呤质量浓度(ρ(6-BA))、萘乙酸质量浓度(ρ(NAA))、吲哚丁酸质量浓度(ρ(IBA))为影响因素，获得回归方程为：

Ir=427.87-51.56ρ(6-BA)-16.49ρ(NAA)-21.42ρ(IBA)-

10.58ρ(6-BA)ρ(NAA)-24.50ρ(6-BA)ρ(IBA)-

H=5.87+0.039ρ(6-BA)-0.12ρ(NAA)+0.49ρ(IBA)-

0.92ρ(6-BA)ρ(NAA)-0.11ρ(6-BA)ρ(IBA)-0.95ρ(NAA)ρ(IBA)-

表4 不同吲哚丁酸质量浓度时的组培增殖率和苗高增长量

表5 3种植物生长调节剂不同组合对不定芽增殖率和苗高增长量影响的Box-Behnken试验结果

由表6可见：增殖率二次多项式模型回归结果显著(P<0.05)，苗高增长量二次多项式模型回归结果极显著(P<0.01)。残差是由两部分组成的，一部分是随机误差或纯误差；另一部分为失拟误差，2个模型失拟项的P值分别为0.195 0、0.086 7，均大于0.05，模型失拟项不显著，说明模型预测值与实际值不拟合的概率不显著，表明这2个模型稳定[8]。

表6 不定芽增殖率、苗高增长量二次多项式模型的方差分析结果

2.5 对红花国槐‘姹紫1号’增殖培养基优化条件的检验

针对增殖率与苗高增长量的回归模型，利用Design-Expert 8.0.6软件中“最优化”功能，以增殖率和苗高增长量取最大值为条件，求解回归模型得到的植物生长调节剂组培增殖最优条件为：6-苄氨基嘌呤质量浓度1.96 mg/L、萘乙酸质量浓度0.45 mg/L、吲哚丁酸质量浓度0.54 mg/L；按照优化条件培养，红花国槐‘姹紫1号’增殖培养基的增殖率为420.31%、苗高增长量为6.08 mm。

为验证优化条件的可靠性，按照最优条件进行增殖培养；考虑到实际操作，将6-苄氨基嘌呤质量浓度、萘乙酸质量浓度、吲哚丁酸质量浓度修正为2.00、0.45、0.55 mg/L。经验证试验，得到，红花国槐‘姹紫1号’增殖培养基的增殖率为(415.87±16.84)%、苗高增长量为(5.97±0.20)mm，与模型的预测值(增殖率420.31%、苗高增长量为6.08 mm)非常接近(见表7)。

表7 按照培养基最优条件试验获得的增殖率、苗高增长量

3 结论与讨论

同一种植物不同的品种，因基因型不同，所需的植物生长调节剂的种类和浓度也不同。组织培养中，细胞分裂素的主要作用，是促进细胞分裂和器官分化，促进侧芽分化和生长，抑制顶端优势、延缓组织衰老；生长素的主要作用，是诱导愈伤组织形成、诱导根的分化和促进细胞分裂[9-10]。本研究团队，10多年前已经建立起普通国槐的组培体系，所需的植物生长调节剂为6-苄氨基嘌呤、萘乙酸，‘姹紫1号’在此培养基上生长表现为，丛生芽节间较短、叶片卷曲不舒展、茎叶生长速度缓慢。单因素试验结果表明，‘姹紫1号’所需的细胞分裂素为6-苄氨基嘌呤、生长素为萘乙酸和吲哚丁酸。

在对国槐丛生芽诱导过程中，培养基内仅添加一种植物生长调节剂，增殖率不高，植株长势不良；与其他细胞分裂素联合使用后，组培苗增殖率及植株长势均有明显提高。已有研究认为，由于细胞分裂素抑制了叶绿素的降解、促进氨基酸等营养物质的运输，进而延缓组织的老化[11]。

响应面法可以在有效减少试验次数的基础上，建立预测模型，进行方差分析、模型诊断，同时进行因素间交互作用的考察[12]。在植物组培的因素优化试验中，最常用的方法是正交试验设计，但正交试验在试验因素较多的情况下不能有效减少试验次数。牟会荣等[13]同时利用正交试验设计和响应面设计两种试验设计方法进行研究，发现采用响应面法进行试验，因素的优化较正交试验法更高效和科学。本研究采用响应面法筛选国槐不定芽增殖中的植物生长调节剂质量浓度最佳组合，再次验证了响应面法在筛选最佳组合方面的高效性和科学性。

迄今为止，响应面法已经在植物组织培养中的初代培养(诱导培养)、继代培养(增殖培养)、生根培养等过程得到广泛应用[14-15]。江林娟等[16]应用响应面法研究马铃薯愈伤组织芽分化率时的生长调节剂组合，最终得到其生长调节剂最优组合。张艳萍等[17]以野生白刺的无菌苗幼嫩茎段为外植体，采用2因素5水平的响应面法对增殖培养中的生长调节剂浓度进行优化，得到的最佳增殖培养基组合为MS培养基+质量浓度为0.22 mg/L的6-苄氨基嘌呤+质量浓度为0.55 mg/L的吲哚丁酸；优化后，增殖系数从3.63提高到3.90。Abbasi et al.[18]在研究滇紫草愈伤组织的继代培养基时也使用了响应面法。彭文书等[19]在研究铁皮石斛生根培养基条件时，使用Plackett-Burman设计等方式，确定了影响铁皮石斛生根培养基条件最重要的因素，分别是萘乙酸质量浓度、6-苄氨基嘌呤质量浓度、香蕉泥量以及马铃薯量；并利用回归方程得到这4个因素的最佳质量浓度组合。李雪雪等[20]利用响应面法成功对葡萄微嫁接组培快繁技术体系(光照时间、氯化汞消毒时间、天然营养物质浓度)进行优化，使葡萄微嫁接苗成活率提高到了(65.2±0.8)%。这充分说明，利用响应面法对植物的组培快繁技术体系进行优化是切实可行的。

目前，国槐增殖因素优化使用的方法多为单因素试验，朱雪峰等[4]以变异国槐的1年生茎段为试验材料，最终得到增殖诱导的最佳培养组合为：0.5倍的MS培养基+质量浓度为0.1 mg/L的萘乙酸+质量浓度为0.4 mg/L的吲哚乙酸，国槐茎段的增殖率为280%。单因素试验设计虽然简单，但无法考虑因素之间的交互作用，无法确定多种因素之间的最佳组合。本研究使用响应面法对国槐增殖培养基进行优化，既能考察因素之间的交互作用，又可确定整个区域内的最优解，同时以增殖率和苗高增长量为评价指标，既进一步提高了增殖效率，又为下一步的生根培养建立了良好的条件。本试验研究表明：在6-苄氨基嘌呤质量浓度为2.0 mg/L左右时，最有利于红花国槐‘姹紫1号’不定芽的增殖。诱导丛生芽时，萘乙酸适宜的质量浓度为0.5 mg/L左右。吲哚丁酸和6-苄氨基嘌呤配合使用时，诱导国槐增殖的吲哚丁酸适宜质量浓度为0.5 mg/L左右。本试验通过单因素试验确定了各植物生长调节剂最佳质量浓度的范围后，再通过响应面分析充分考虑6-苄氨基嘌呤、萘乙酸、吲哚丁酸之间的交互作用，并通过响应曲面寻找最优组合为：6-苄氨基嘌呤质量浓度为1.96 mg/L、萘乙酸质量浓度为0.45 mg/L、吲哚丁酸质量浓度为0.54 mg/L；红花国槐‘姹紫1号’增殖培养基的苗高增长量为6.08 mm、增殖率为420.31%，增殖效果理想。

本研究主要从MS培养基中添加最适宜质量浓度的6-苄氨基嘌呤、萘乙酸、吲哚丁酸3种植物生长调节剂，采用响应面法对国槐不定芽增殖培养基进行优化，以期提高国槐组培快繁中的增殖率和苗高增长量，筛选出最优激素组合。在相同条件下，优化后的培养基尽可能地减少了添加植物生长调节剂的种类和降低了其用量，提高了增值率及苗高增长量，并最终降低了生产成本。