STC1、TWEAK、miR-183在COPD患者中的表达及相关性研究

蒋丽萍，李文珍，韦江妹

(海南医学院第二附属医院肿瘤外科，海南 海口 570311)

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)是一种以持续气流受限和相应呼吸系统症状为临床特征的呼吸疾病，主要临床表现为咳嗽、气促、喘息等[1]。COPD随着病情加重可进一步发展为肺心病、呼吸衰竭，严重影响患者生命安全，世界卫生组织报道，随着发达国家人口老龄化加剧和发展中国家吸烟率提升，未来40年COPD患病率会持续上升，预计到2060年COPD及相关疾病死亡病例将超过540万[2]。尽早评估COPD严重程度对临床制定个体化方案和防治病情恶化意义重大。COPD的发病机制尚未完全明确，目前研究认为是吸入有害气体或颗粒可引起气道炎症反应和氧化应激及蛋白酶/抗蛋白酶失衡等多种途径参与COPD发生发展[3-4]。斯钙素1(stanniocalcin 1，STC1)是一种糖蛋白激素，研究报道STC1能通过抑制氧化损伤和细胞凋亡保护视网膜神经节细胞[5]。肿瘤坏死因子相关弱凋亡诱导因子(tumor necrosis factor-like weak inducer of apoptosis，TWEAK)是一种多功能细胞因子，具有调节炎症和细胞增殖、分化、黏附等功能[6]。微小RNA(microRNA，miRNA)是一类基因调控分子，能影响靶基因表达调控相关信号通路参与COPD发生发展[7]。研究报道miR-183与炎症疾病狼疮肾炎的疾病活动程度相关[8]。探讨STC1、TWEAK、miRNA-183在COPD患者中的表达及相关性。现报告如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2018年1月—2020年12月我院收治的COPD患者114例为COPD组，其中男性68例，女性46例；年龄38～78岁，平均(62.54±5.87)岁；体重指数18～25，平均22.54±1.52；病程2～15年，平均(5.36±1.78)年。纳入标准：①符合《慢性阻塞性肺疾病诊治中国指南(2013年修订版)》[9]COPD诊断标准；②年龄≥18岁；③临床资料完整者。排除标准：①肺部手术史或合并肺间质纤维化、肺结核、哮喘、支气管肺炎等其他肺部疾病者；②合并急慢性炎症性疾病者；③合并心、肝、肾等重要脏器损害者；④恶性肿瘤患者；⑤合并免疫、血液系统疾病者；⑥近3个月接受免疫抑制剂、激素药物治疗者。另选取同期体检健康者63例为对照组，其中男性38例，女性25例；年龄24～78岁，平均(62.11±5.72)岁；体重指数18～25，平均22.42±1.48。2组一般资料比较差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。

本研究经医院伦理委员会批准，患者及其家属均知情研究且签署知情同意书。

1.2方法

1.2.1肺功能检查 所有受试者入院后2 h内使用麦邦MAS-99肺功能检测仪检查第1秒用力呼气容积(forced expiratory volume in one second，FEV1)和用力肺活量(forced vital capacity，FVC)，计算FEV1/FVC。

1.2.2血清指标测定 采集COPD组入院时和对照组体检时静脉血，3 000 r/min离心10 min，半径8 cm，取上清液，-80 ℃保存待检。部分使用Trizol试剂盒提取血清总RNA，验证RNA浓度和纯度后，Takara逆转录试剂盒转录合成cDNA，进行qRT-PCR扩增。miR-183正向引物：5′-ACATCACATCGGTAGTTGCCAT-3′，反向引物：5′-AAACAAAGAGGTAAAGGTGCA-3′。反应体系：1 μL cDNA、0.3 μL引物、5 μL SYBRPremix Ex Taq II Mix、3.4 μL ddH2O；反应条件：95 ℃ 10 min，95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，循环40次。内参U6正向引物：5′-CCACGAGTCTCTTT-CGAGC-3′，反向引物：5′- TTGACGTTTCACGA-TACAT -3′。2-△△Ct法计算血清miR-183相对表达量。其余部分酶联免疫吸附测定(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)法测定血清STC1、TWEAK、白细胞介素(interleukin，IL)6、IL-8水平，硫代比色法测定血清丙二醛(malondialdehyde，MDA)水平，黄嘌呤氧化法测定血清超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)水平，试剂盒均由上海梵态生物科技有限公司提供，所有操作严格按照试剂盒说明书进行。

1.3病情严重程度和预后分组 COPD患者入院吸入支气管舒张剂后参考《慢性阻塞性肺疾病诊治中国指南(2013年修订版)》[9]根据气流受限程度分级，极重度：FEV1<30%；重度：FEV130～49%；中度：FEV150%～79%；轻度：FEV1≥80%；根据气流受限程度将患者分为重度组(极重度和重度)23例、中度组48例、轻度组43例。并根据《慢性阻塞性肺疾病诊治中国指南(2013年修订版)》[9]接受常规平喘、化痰、抗感染、无创通气等治疗，以患者痊愈出院或死亡的研究终点，分为病死组22例和存活组92例。

1.4统计学方法 应用SPSS 26.0统计软件分析数据。计数资料比较采用χ2检验、Fisher检验；等级资料比较采用Z检验；计量资料比较采用独立样本t检验、SNK-q检验；相关性采用Pearson相关性分析；ROC曲线分析血清STC1、TWEAK、miR-183水平对COPD患者预后不良的预测价值，并计算曲线下面积(area under curve，AUC)。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1COPD组和对照组血清STC1、TWEAK、miR-183水平比较 COPD组血清STC1水平低于对照组，TWEAK、miR-183水平高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 COPD组和对照组血清STC1、TWEAK、miR-183水平比较Table 1 Comparison of serum STC1, TWEAK and miR-183 levels between the COPD and control groups

2.2COPD组和对照组肺功能、氧化应激、炎症指标比较 COPD组FEV1、FEV1/FVC和血清MDA、IL-6、IL-8水平高于对照组，SOD水平低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 COPD组和对照组肺功能、氧化应激、炎症指标比较Table 2 Comparison of lung function, oxidative stress and inflammation indicators between the COPD and control groups

2.3不同COPD严重程度患者血清STC1、TWEAK、miR-183水平比较 轻、中、重度组血清STC1水平依次降低，TWEAK、miR-183水平依次升高，差异有统计学意义(P<0.05)，见表3。

表3 不同COPD严重程度患者血清STC1、TWEAK、miR-183水平比较Table 3 Comparison of serum STC1, TWEAK and miR-183 levels in patients with different COPD severity

2.4不同COPD严重程度患者血清氧化应激、炎症指标比较 轻、中、重度组血清MDA、IL-6、IL-8水平依次升高，SOD水平依次降低，差异有统计学意义(P<0.05)，见表4。

表4 不同COPD严重程度患者血清氧化应激、炎症指标比较Table 4 Comparison of serum oxidative stress and inflammation indicators in patients with different COPD severity

2.5COPD组血清STC1、TWEAK、miR-183水平与肺功能、氧化应激、炎症指标的相关性分析 Pearson相关性分析显示，COPD组血清STC1水平与FEV1、FEV1/FVC、SOD呈正相关，与MDA、IL-6、IL-8呈负相关，差异有统计学意义(P<0.05)，TWEAK、miR-183水平与FEV1、FEV1/FVC、SOD呈负相关，与MDA、IL-6、IL-8呈正相关，差异有统计学意义(P<0.05)。见表5。

表5 COPD组血清STC1、TWEAK、miR-183水平与肺功能、氧化应激、炎症指标的相关性Table 5 Correlation of serum STC1, TWEAK and miR-183 levels with lung function, oxidative stress and inflammation indicators in the COPD group

2.6病死组与存活组血清STC1、TWEAK、miR-183水平比较 病死组血清STC1水平明显低于存活组，TWEAK、miR-183水平明显高于存活组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表6。

表6 病死组与存活组血清STC1、TWEAK、miR-183水平比较Table 6 Comparison of serum STC1, TWEAK and miR-183 levels between the death and survival groups

2.7血清STC1、TWEAK、miR-183水平对COPD患者预后不良的预测价值 ROC曲线显示，STC1+TWEAK+miR-183预测COPD患者预后不良的AUC明显大于各指标单独预测(Z=2.632、2.680、3.189，P=0.009、0.007、0.001)。见表7，图1。

表7 血清STC1、TWEAK、miR-183水平对COPD患者预后不良的预测价值Table 7 Predictive value of serum STC1, TWEAK and miR-183 levels in poor prognosis in COPD patients

图1 血清STC1、TWEAK、miR-183水平预测COPD患者预后不良的ROC曲线Figure 1 ROC curves of serum STC1, TWEAK and miR-183 levels in predicting poor prognosis in COPD patients

3 讨 论

COPD中央气道壁存在T细胞、B细胞、中性粒细胞、巨噬细胞等多种炎性细胞浸润，增加黏液分泌物阻塞气道管腔导致气道阻塞，也可促进成纤维细胞和平滑肌增生导致气道重塑[10]。同时吸入有害气体或颗粒后，可增加肺部活性氧含量，引起体内氧化与抗氧化失衡，导致气道和肺组织损伤，破坏肺实质，也是COPD进展机制之一[11]。本研究中COPD组血清氧化损伤标志物SOD水平和炎症因子IL-6、IL-8水平明显升高，抗氧化酶SOD水平明显降低，同时轻、中、重度组血清SOD水平依次降低，MDA、IL-6、IL-8水平依次升高，符合上述报道机制。尽管目前已明确氧化应激和炎症反应在COPD中的作用，并已开发相关抗氧化应激和炎症反应治疗方法，但COPD仍然是导致人类死亡的重要病因，因此还需探索相关生物标记物，以阐述COPD发病机制和指导临床治疗。

STC1是一种内分泌因子，在所有组织中均有表达，参与调节钙离子和磷酸盐稳态，既往研究多报道其在各种肿瘤中的作用，参与肿瘤细胞分化和血管生成等过程[12-13]。近年研究报道，STC1还参与细胞凋亡和氧化应激等过程。一项肺癌研究显示，间充质基质细胞能通过分泌STC1降低肺癌细胞内活性氧水平，增加肺癌细胞存活率[14]。同时研究报道，齐墩果酸能通过STC1调节解偶联蛋白2表达，减轻阿尔茨海默病细胞氧化应激[15]。但是否通过氧化应激参与COPD尚不明确。本研究结果显示，COPD组血清STC1水平明显低于对照组，轻、中、重度组血清STC1水平依次降低，并与FEV1、FEV1/FVC呈正相关，说明STC1参与COPD发生发展。进一步分析，COPD组血清STC1水平与SOD呈正相关，与MDA、IL-6、IL-8呈负相关，说明STC1与COPD病情进展中的氧化应激和炎症反应密切相关。Tang等[16]通过脂多糖诱导小鼠急性肺损伤显示，肺部存在明显氧化应激和炎症反应，注射重组STC1后肺部氧化应激和炎症明显改善。考虑是STC1参与抗氧化应激过程，STC1水平降低反映机体氧化应激增加，过度氧化也会刺激肺部炎症反应，且随着炎症反应加重，又可加剧氧化与抗氧化失衡，因此STC1能通过氧化应激和炎症反应途径参与COPD进展，相关机制还需进一步证实。

TWEAK是TNF家族一个新成员，在炎症、氧化应激、机械、组织损伤过程中可大量分泌，并结合细胞表面受体Fn14激活核因子κB信号通路，参与炎症反应[6]。近年多项研究也报道TWEAK与急性ST段抬高型心肌梗死、心肾综合征等炎症疾病密切相关[17-18]。而同样作为一种炎症疾病，关于TWEAK与COPD病情进展的关系却无研究报道，本研究结果显示，COPD组血清TWEAK水平明显高于对照组，轻、中、重度组血清TWEAK水平依次升高低，并与FEV1、FEV1/FVC呈负相关，说明TWEAK参与COPD发生发展，分析与COPD患者炎症反应、氧化应激下刺激TWEAK大量分泌有关。本研究结果也显示，COPD组血清TWEAK水平与SOD呈负相关，与MDA、IL-6、IL-8呈正相关，进一步说明TWEAK与COPD病情进展中的氧化应激和炎症反应密切相关。Fn14是目前唯一确认的TWEAK受体，一旦Fn14表达上调，TWEAK就能结合Fn14胞外配体，激活下游信号转导通路[6]。体外实验显示，敲除Fn14能减少肺微血管胞间黏附分子1和单核细胞趋化蛋白1表达，减少巨噬细胞和中性粒细胞浸润，修复脓毒症引起的急性肺损伤[19]。本研究验证了该研究结果，但关于TWEAK在COPD发生发展中的作用尚缺乏证据。

miRNA是内源性非编码长约22个核苷酸的小分子RNA，持续慢性炎症和氧化应激能引起某些miRNA异常表达，参与COPD的发生[7]。如miR-195-5p可靶向唾液酸结合Ig样凝集素1抑制COPD的炎症反应[20]。miR-183定位于人染色体7q32.2，为视网膜高度表达特异性miRNA，既往研究多报道其在眼科疾病中的作用，近年研究显示，多种炎症疾病中也能出现miR-183异常表达。如狼疮肾炎患儿血清miR-183呈低表达[8]。同时上调miR-183能抑制缺血性卒中核因子κB活化，减轻炎症[21]。曾宗鼎等[22]通过qRT-PCR检测COPD患者外周血miRNAs，结果显示，外周血miR-183表达显著上调。本研究结果显示，COPD组血清miR-183水平明显高于对照组，轻、中、重度组血清miR-183水平依次升高，并与FEV1、FEV1/FVC呈负相关，说明miR-183参与COPD发生发展。同时COPD组血清miR-183水平与SOD呈负相关，与MDA、IL-6、IL-8呈正相关，说明miR-183与COPD病情进展中的氧化应激和炎症反应密切相关，这与林烈桔等[8]研究报道的miR-183在狼疮肾炎患儿血清表达降低不符，推测与miR-183在不同组织和疾病中的表达不同有关，还需进一步研究。本研究结果还显示，病死组血清STC1水平明显降低，TWEAK、miR-183水平明显升高，提示STC1、TWEAK、miR-183还可能与COPD患者预后不良有关，ROC曲线也证实，三者均对COPD患者预后不良具有一定预测价值，同时通过联合3个指标能显著增加AUC，说明联合预测能提升COPD患者预后不良预测价值。

综上所述，COPD患者血清STC1水平降低，TWEAK、miR-183水平升高，可能通过氧化应激和炎症反应参与COPD病情进展，可作为患者预后不良预测指标。但关于三者与COPD的具体关系还需进一步证实。