山西平陆野生葛根悬浮细胞培养体系的优化

张 静，王刚狮，刘瑞霞，时宝凌，廉梅霞

（山西林业职业技术学院，山西 太原 030009）

1 材料与方法

1.1 材料

将采自山西省运城市平陆县的野生葛根根部进行组织培养，愈伤组织诱导培养基条件为：MS+1.0 mg/L6-BA+2.0 mg/L 2，4-D+0.3 mg/L KT+0.5 mg/L NAA；16 h 光照/8 h 黑暗。此时愈伤组织质地疏松，颜色为奶白色，呈颗粒状，易分散。只有质地疏松、淡黄色的颗粒状愈伤组织才能作为建立悬浮细胞培养体系的材料[1-3]。

1.2 方法

1.2.1 配置不同种类培养基进行悬浮细胞培养并测总黄酮含量

选择4种培养基：分别为MS、B5、N6和WS 作为基本培养基，其中添加的外源激素种类和含量均相同，具体如下，2.0 mg/L 2.4-D+0.5 mg/L KT+3%蔗糖。在超净工作台中，用镊子挑取1.0±0.1 g的新鲜愈伤组织，分别接种于4种液体培养基中，每种培养基接30瓶，将接种好的三角瓶置于摇床上，调整转速为110 r/min，培养温度为26℃，用黑布遮挡摇床，保证黑暗条件培养。26 d 后，取出细胞培养物，放入离心管，在5 000 rmp下离心15 min，取出后记录细胞鲜质量。烘干，烘箱温度为55℃，精密称取0.1 g粉末，放置于具塞锥形瓶中，加入70%的酒精10 mL，70℃超声处理30 min，过滤后倒入10 mL容量瓶中，用70%的酒精定容置刻度线。利用分光光度计测定其在250 nm下的吸光度，计算得到总黄酮含量。

1.2.2 设计正交实验测定不同植物激素对悬浮细胞生长量及总黄酮含量的影响

在MS 培养基中添加不同的植物生长素。激素种类与含量见表1。培养条件为：蔗糖3%、pH6、26℃暗培养，26 d后精密测量细胞鲜质量及合成的总黄酮含量，试验重复6次。

表1 植物激素对悬浮细胞影响的正交实验Tab.1 The orthogonal experiment of effects of plant hormones on suspension cells

1.2.3 pH值对悬浮细胞生长及总黄酮合成的影响

分别调节培养基的pH 为4.8、5.3、5.8、6.3 和6.8。每种pH 培养基60瓶。培养条件为25℃，黑暗培养26 d，精密测定其细胞鲜质量以及总黄酮含量。

2 结果

2.1 培养基种类对悬浮细胞生长量及总黄酮合成的影响

由图1 可知：不同基本培养基对野葛悬浮细胞生长有很大的影响，总黄酮含量也随之变化。其中，B5 培养基细胞鲜质量最大，高达10 g，高于MS、N6 和WS 其他3 种培养基，悬浮细胞呈褐黄色，分散性好。其次，MS 培养基中细胞鲜质量为7.35 g，仅次于B5 培养基，悬浮细胞颜色为奶黄色。在N6和WS 培养基中，不仅细胞生长缓慢且聚集成大块黑褐色的硬块。总黄酮含量与悬浮细胞的生长量呈正相关，依次是B5培养基最高为13.12 %，MS 培养基为10.45%，N6 培养基为6.32%，WS培养基为6.22%。

图1 培养基种类对悬浮细胞生长量及总黄酮合成的影响Fig.1 The effect of medium type on growth of suspension cells and synthesis of total flavonoids

2.2 植物激素对悬浮细胞生长量及总黄酮合成的影响

4种激素对野葛悬浮细胞生长及总黄酮含量的影响如表2。

表2 植物激素对悬浮细胞生长量及总黄酮合成的影响Tab.2 The effects of plant hormones on the growth of suspension cells and the synthesis of total flavonoids

由表3极差分析R可以看出，4种激素对细胞生长量影响大小依次是：2,4-D＞KT＞6-BA ＞NAA。通过比较k 值大小得出：最优激素组合为A2B3C3D3，即1.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L 2，4-D+0.5 mg/L KT+1.0 mg/L NAA。其中6-BA、2,4-D、KT 对野葛悬浮细胞生长的影响均达到极显著水平，NAA对悬浮细胞生长的影响较小。

表3 植物激素对悬浮细胞生长量影响的极差分析Tab.3 The range analysis of the effect of plant hormones on the growth of suspension cells

由表4 极差分析可知，4 种激素对于总黄酮合成影响大小依次是：NAA＞2,4-D＞6-BA＞KT。 最 优激素组合为A3B3C3D2，即2.0 mg/L 2，4-D+1.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L NAA+0.2 mg/L KT。NAA 与2，4-D 对悬浮细胞总黄酮含量的影响达到极显著水平，6-BA和KT的影响达到显著水平。

表4 植物激素对悬浮细胞总黄酮合成影响的极差分析Tab.4 The range analysis of the effect of plant hormones on the synthesis of total flavonoids in suspension cells

2.3 培养基pH值对悬浮细胞生长及总黄酮合成的影响

由图2可知：当pH为5.8时，细胞合成的总黄酮含量最高为11.2%。当培养基的pH为5.3时，细胞鲜质量最大为8.7 g。因此，最适合悬浮细胞培养的pH 与最适合提供代谢产物的培养基的pH有所不同。

3 讨论与结论

3.1 B5培养基是最适合野葛悬浮细胞的生长的基本培养基

悬浮细胞培养是在液体中培养，相对于固体培养基而言，液体中的溶质等营养物质更容易被细胞吸收利用，因而细胞对培养基的种类更加敏感，同时悬浮细胞培养的目的是获得较高的目的产物，而次级代谢产物是细胞分泌所产生的，因而高细胞生物量与高代谢产物含量理论上呈正相关，与本研究结果保持一致。因此，在悬浮细胞培养时，选择B5培养基可以获得较高的细胞生长量和代谢产物总黄酮含量。

3.2 野葛悬浮细胞生长与代谢产物总黄酮合成所需最适激素不同

在药用植物细胞培养过程中，外源激素种类选择不当、激素浓度过高或过低、激素相互间的配比不合适均会抑制植物细胞生长与代谢产物积累[4]。正交试验结果显示，2，4-D、6-BA和KT这3种植物激素的添加可以显著提高悬浮细胞的生物量，而要提高代谢产物总黄酮的含量则需要适当添加NAA，说明NAA在调节某些次级代谢产物合成的关键酶的表达中起作用[4]。因此，在悬浮细胞培养中可以采用2 步培养法，以获得最高的次级代谢产物量。Van der plas 等[5]在Morinda citrifolia 细胞悬浮培养中也发现，NAA 是产生目标代谢产物的必要条件。

3.3 野葛细胞生长与总黄酮合成所需最适培养基的pH值不同

pH 对悬浮细胞的影响主要体现在改变细胞膜的通透性以及引起有关蛋白质变性等方面。植物细胞培养时，其pH一般需要控制在微酸性的范围内，即pH为5.3～6.0[6]。这与本研究结果一致，即微酸环境有利于细胞的增殖与次级代谢物的产生。