阿魏酸通过调节GSK-3β减轻阿尔茨海默样变化

许英，陈玲，张兰，朱斌，杨阳，王晓梅，洪倩*（1.徐州医科大学附属淮海医院，江苏 徐州 221004；2.中国人民解放军陆军第七十一集团军医院，江苏 徐州 221004）

阿尔茨海默病（AD）是最常见的神经退行性疾病，是老年人群中主要的痴呆症。据估计，2018年全球有4400万人患有AD。淀粉样斑块的积累和神经原纤维缠结（NFT）的形成是AD的两个典型病理特征。β-淀粉样蛋白（Aβ）聚集在有害的寡聚体和原纤维中，包括神经元细胞死亡。已知该寡聚体会诱导氧化应激，从而触发神经炎症并加速疾病的发展。因此，抑制Aβ的产生，从治疗和预防的角度来看可能是具有意义的。此外，tau过度磷酸化被认为是tau蛋白病的主要诱因，大量证据表明，在体外和体内多个AD相关位点都显示强烈的tau磷酸化[1]。

阿魏酸（4-羟基-3-甲氧基肉桂酸，FA）是一种酚类化合物，天然存在于植物细胞的细胞壁中，已被证明具有广泛的药理作用，如抗炎、抗糖尿病、抗肿瘤、抗衰老和神经保护。前期研究证实阿魏酸对脂多糖（LPS）刺激或Aβ25-35损伤的PC12细胞具有保护作用，表明阿魏酸具有潜在的神经保护作用[2-4]。然而，关于阿魏酸降低Aβ水平作用的确切机制尚不清楚。在本研究中，课题组使用稳定转染了人类淀粉样蛋白前体蛋白（APP）的人类神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞来评估阿魏酸对AD的影响及相关分子机制。

1 材料

1.1 试药

阿魏酸（中国食品药品检定研究院，批号：110773-201614，通过归一化HPLC-ELSD检测确定纯度超过98%）；MTS、caspase-Glo 3/7分析检测试剂盒（Promega公司）；Tris缓冲液、甘氨酸、SDS和胎牛血清（BSA）（Amresco公司）；盐酸嘌呤霉素、DMEM培养基（Gibco公司）；Cleaved caspase-9、GAPDH兔单克隆抗体、山羊抗兔-HRP和山羊抗小 鼠-HRP（Cell Signaling Technology公司）；磷酸化GSK-3β（Y216）兔多克隆抗体（Abcam公司）；Aβ40和Aβ42 ELISA检测试剂盒（Thermo Fisher Scientific）；Aβ42（Sigma-Aldrich）。其他化学药品均为国产分析纯。

1.2 仪器

CO2培养箱（ThermoForma公司）；Quintix 224-1CN 型电子分析天平（最大载荷 220 g，分度值 0.1 mg，德国 Sartorius公司）；Western blot转膜仪（Bio-Rad公司）；电泳仪（Amersham公司）；TS-2型脱色摇床及 TS-8型转移脱色摇床（江苏海门市麒麟贝尔仪器制造有限公司）；Minispin5452 型高速离心机（德国 Eppendorf 公司）；Molecular Devices Flex Station 3微孔板读数仪（美谷分子公司）；BC-5390CRP 型全自动细胞计数仪（迈瑞医疗国际公司）。

2 方法

2.1 细胞培养及单克隆细胞系的建立

SH-SY5Y人类神经母细胞瘤细胞系购自中国科学院上海细胞库（No.CRL-2266），进口自ATCC。使用DMEM培养基[含10%胎牛血清，100 U·mL-1青霉素/链霉素，非必需氨基酸和丙酮酸钠（1 mmol·L-1）]，于37℃、5%CO2孵箱中培养。使用质粒载体HBLV-H-APP-3XFLAGZNGREEN-PURO或HBLV-ZNGREEN-PURO（Hanbio）在SH-SY5Y细胞中构建稳定过表达人APP的细胞系并命名为NC和SH-APP，通过在含嘌呤霉素（8 μg·mL-1）的选择性培养基中维持培养。单克隆细胞系的构建按照文献所述的方法进行[5-6]。

2.2 细胞活力测定

将细胞以每孔1×104个细胞的密度接种到96孔板中，并在37℃、5%CO2的培养箱中培养48 h。将MTS（20 μL/孔）加入到每个孔中。温育2 h后，使用微孔板读数仪于450 nm处检测吸光度。

2.3 Caspase-3/7活性测定

根据说明书的方法，使用caspase-Glo 3/7检测试剂盒检测caspase-3/7活性。具体方法为：将NC和SH-APP细胞以每孔1×104个细胞的密度接种到96孔板中，并用不同浓度的阿魏酸处理48 h。48 h后，每孔添加100 μL检测试剂，并在黑暗中于室温孵育1 h后，在微孔板上检测发光，未处理细胞的caspase-3/7活性定义为相对100% caspase-3/7活性。

2.4 Aβ40和Aβ42分泌检测

使用人Aβ40和Aβ42 ELISA试剂盒检测稳定转染人APP细胞系中分泌的Aβ水平。将NC和SH-APP细胞在6孔板中培养过夜，并用不同浓度的阿魏酸处理细胞48 h。收集上清液，并向其中加入蛋白酶抑制剂。根据试剂盒说明操作，将上清液用作ELISA样品，每个样品一式两份进行分析。同时，保存细胞用于Western blot研究。

2.5 细胞凋亡检测

采用流式细胞仪测定细胞凋亡，将NC和SH-APP细胞以每孔4×105个细胞的密度接种在6孔板中，并用不同浓度的阿魏酸处理细胞48 h。然后去除细胞培养基，并用PBS洗细胞两次，收获细胞并用含有Annexin 和PI试剂的结合缓冲液在黑暗中染色15 min，使用流式细胞仪对细胞悬浮液进行定量检测，使用Flow Jo软件对检测结果进行数据分析。

2.6 蛋白质印迹分析

将阿魏酸处理过的全细胞提取物在裂解缓冲液[20 mmol·L-1pH 7.4 Tris，250 mmol·L-1NaCl，2 mmol·L-1EDTA（pH 8.0），0.1% Triton X-100、0.01 mg·mL-1抑肽酶，0.005 mg·mL-1亮肽素，0.4 mmol·L-1PMSF和4 mmol·L-1NaVO4]中裂解。将裂解液在12 000×g下离心10 min以除去不溶物，并用10% SDS凝胶溶解。电泳后，将蛋白质电转至硝酸纤维素膜上，用5%脱脂牛奶封闭，并加入一抗（1∶1000）4℃孵育过夜。洗涤印迹，将其暴露于含有辣根过氧化物酶（HRP）的二抗1 h，最后通过ECL化学发光法进行蛋白印迹检测，蛋白质的相对密度通过Image J软件进行分析。

2.7 Morris水迷宫实验

2.7.1 动物分组 大鼠随机分为7组，分别为正常组，假手术组，模型组，多奈哌齐阳性药组，阿魏酸低、中、高剂量组（1.5、3、6 g·kg-1）。正常组和假手术组每组12只，雌雄各半，其余5组每组13只。

2.7.2 Aβ致AD痴呆模型的建立 大鼠适应性饲养5 d后，采用立体定位技术双侧海马注射Aβ42（2 μg·μL-1）5 μL建立大鼠AD模型。假手术组注射等体积的PBS，正常对照组不进行注射。造模后一周开始灌胃给药，剔除造模过程中死亡动物后，连续给药5周。

2.7.3 水迷宫检测 采用Morris水迷宫检测大鼠空间学习记忆行为。第1、2日为可见平台训练，第3、4、5日为隐藏平台训练，第6日为空间探索实验。可见平台训练：将插有旗子的水迷宫平台（旗子高于平台5 cm）置于水迷宫某一象限，放入25℃左右的水至没过平台1.5 cm。每日从四个象限（4个入水点）中将大鼠面向池壁放入水中，使其自由游泳90 s，90 s内大鼠找到平台并上台停留15 s后将其从平台上取下休息，并记录大鼠从入水开始至爬上平台所需的时间（潜伏期）。若90 s内动物未找到平台，则人为地将大鼠引导至平台，并停留15 s，潜伏期记为90 s。隐藏平台训练：将水迷宫平台上插有的旗子撤去，但平台所在的位置不变，放入25℃左右的水至没过平台1.5 cm。训练方法同可见平台训练。空间探索实验：撤除平台，任选某一象限将各组大鼠依次从该象限面向池壁放入水中，使其自由游泳90 s，计算机监测记录大鼠在原平台所在象限停留的时间及穿越原平台所在区域的次数（行为学测试过程中应保持光线柔和、室内安静、各参照物位置不变）。

2.8 数据分析

采用SPSS 16.0软件对实验数据进行独立样本t检验，计量结果均以±s表示，多组间比较，方差齐采用单因素方差分析，方差不齐则采用秩和检验，P＜0.05为差异有统计学意义，每个实验重复3次或更多独立实验。

3 结果

3.1 SH-APP稳定细胞株的构建及验证

本研究首先构建了稳定表达人APP的细胞株，然后通过Western blot法和ELISA法分别检测了稳定细胞株中Aβ40和Aβ42的表达情况以验证稳定细胞株是否成功构建。结果见图1，Western blot检测结果显示，与NC细胞相比，SH-APP细胞中Aβ总蛋白的表达显著升高。NC细胞和SH-APP细胞裂解物中Aβ40和Aβ42水平以及培养基中Aβ42水平均无显著差异；SH-APP细胞培养基中的Aβ40水平显著增加。上述结果提示SH-APP稳定细胞株构建成功，后续研究中选择细胞培养基中Aβ40的分泌水平来进行药效的评估。

图1 SH-APP细胞株的构建及Aβ表达水平Fig 1 Construction of SH-APP cell line and expression level of Aβ

3.2 阿魏酸对SH-APP细胞活力及Aβ40水平的影响

与NC细胞相比，SH-APP的细胞活力显著降低，表明SH-APP细胞具有潜在的神经毒性，而不同浓度的阿魏酸（0.625～10 μmol·L-1）处理后可显著提高细胞活力，提高细胞存活率（见图2A）。同时，阿魏酸（0.625～10 μmol·L-1）处理SH-APP细胞48 h后能剂量依赖性地降低Aβ40分泌水平（见图2B），结果表明阿魏酸在SH-APP细胞中具有潜在神经保护作用。

图2 阿魏酸对SH-APP细胞活力（A）和淀粉样蛋白β（Aβ）分泌的影响（B）Fig 2 Effect of FA on SH-APP cells viability（A）and amyloid beta Aβ40 secretion（B）

3.3 阿魏酸对SH-APP细胞凋亡的影响

如图3A所示，caspase-3/7活性检测结果显示，与SH-APP组相比，阿魏酸（1.25～10 μmol·L-1）处理的SH-APP细胞中caspase-3/7活性明显降低。流式细胞仪检测结果显示，NC细胞中细胞凋亡率为3.3%，而SH-APP细胞中细胞凋亡率上升至10.49%，2.5、5、10 μmol·L-1阿魏酸处理后的SH-APP细胞中细胞凋亡率分别降低至4.0%、3.6%和3.3%，显示阿魏酸具有显著的抗凋亡作用（见图3B），结果表明阿魏酸可能通过影响细胞凋亡发挥对SH-APP细胞的保护作用。

图3 阿魏酸对SH-APP细胞凋亡的影响Fig 3 Effect of FA on the apoptosis of SH-APP cells

3.4 阿魏酸对SH-APP细胞tau蛋白磷酸化的影响

如图4所示，与SH-APP组细胞相比，经阿魏酸（6.25～25 μmol·L-1）处理的SH-APP细胞tau蛋白在丝氨酸199/202和396处的磷酸化水平显著降低，表明阿魏酸抑制了 SH-APP细胞中的tau蛋白磷酸化。

图4 阿魏酸对tau蛋白磷酸化的影响Fig 4 Effect of ferulic acid on tau hyperphosphorylation

3.5 阿魏酸对SH-APP细胞中GSK-3β及caspase-9蛋白的影响

与SH-APP组细胞相比，用 25 μmol·L-1阿魏酸处理的SH-APP细胞的p-GSK-3β（Y216）水平显著降低（见图5）。此外25 μmol·L-1阿魏酸能显著抑制SH-APP细胞中裂解的caspase-9水平。上述结果提示阿魏酸可能通过调节GSK-3β相关的凋亡途径发挥神经保护作用。

图5 阿魏酸对GSK-3β和C-caspase-9的影响Fig 5 Effect of ferulic acid on GSK-3β and cleaved caspase-9

3.6 水迷宫实验

采用Morris水迷宫检测大鼠的空间学习、记忆能力，观察阿魏酸对Aβ模型大鼠的改善作用。如表1所示，与假手术组相比，模型组大鼠表现出较长的潜伏期，表明其空间学习探索能力的损伤。与模型组大鼠相比，阿魏酸低、高剂量组大鼠潜伏期有所缩短，表明大鼠的学习记忆能力得到一定改善。

撤出平台后，水迷宫实验中大鼠的行为由空间探索记忆能力决定。穿台次数是评价空间探索记忆能力的一个指标。如表1、图6所示，经5 d的训练后，模型组大鼠在90 s内的穿台次数比假手术组明显减少。与模型组大鼠相比，阿魏酸各剂量组大鼠的穿台次数明显增加。此外，在空间探索阶段，模型组大鼠在目标象限停留的时间比假手术组有所缩短，阿魏酸各剂量组较模型组有较长的目标象限停留时间，表明大鼠记忆能力有所改善。

图6 大鼠在空间探索实验中的轨迹图Fig 6 Swimming track diagram of rats in space exploration test

表1 阿魏酸对大鼠Morris水迷宫实验的影响 Tab 1 Effect of ferulic acid on model rat in Morris Water Maze Behavior test

4 讨论

在本研究中，我们利用人神经母细胞瘤SHSY5Y细胞构建了一种特征明确的稳定表达人APP的SH-APP细胞AD模型，并初步考察了阿魏酸对SH-APP细胞的影响。结果显示稳定表达APP的SH-APP细胞中Aβ40的水平显著升高，阿魏酸处理后减轻了SH-APP细胞中Aβ40水平。同时，阿魏酸显著升高SH-APP细胞的细胞活力，并抑制了细胞的凋亡。此外，阿魏酸能显著抑制SH-APP细胞中tau蛋白Ser 199/202和Ser 396位点的过度磷酸化，这对形成成对的螺旋细丝至关重要，初步的作用机制可能是阿魏酸通过调节磷酸化GSK-3β蛋白和抑制促凋亡蛋白如caspase-9的表达来发挥神经保护作用，这与前期报道的阿魏酸通过PI3K/Akt信号传导激活GSK-3β的结果一致[3]。

β淀粉样蛋白积聚是AD的主要病理标志之一，Aβ是由β淀粉样蛋白APP通过β和γ分泌酶分泌淀粉样蛋白生成途径形成的[7-9]。Aβ的积累导致神经元损伤和稳定性下降、恶化、突触抑制、氧化应激，神经元功能障碍和炎症[10-12]。FDA于2021年6月7日批准Biogen的针对淀粉样β蛋白的单抗aducanumab上市，用于治疗AD源性轻度认知障碍及轻度AD，这是自2003年以来首个批准的治疗AD的新药，也是首个能阻止疾病进展的药物[13]。本实验结果表明，阿魏酸在0.625～10 μmol·L-1可以有效抑制Aβ40的积累。然而，阿魏酸是否直接影响Aβ的合成尚需进一步研究。

在培养的神经元中，大量证据表明Aβ的毒性一部分是通过对多种激酶的激活而引起tau磷酸化的增加来介导的，而GSK-3β是其中关联性最强的一种激酶，被确定为tau发病的主要激酶[14-15]，在体外和体内多个AD相关位点都能增强tau磷酸化，过表达GSK-3β的转基因小鼠显示出tau的蛋白高度磷酸化，微管破坏和神经元凋亡[16]。另外，Aβ增强了培养的神经元中GSK-3β的活性，阻断GSK-3β的表达或活性可抑制Aβ诱导的tau磷酸化和神经元凋亡[17]。此外，GSK-3β在神经元细胞死亡，抑制抗凋亡蛋白[例如环状AMP反应元件结合蛋白（CREB）]的活性以及增强促凋亡蛋白（例如裂解的caspase-9和caspase-3）中发挥重要的作用[18-19]。近期研究表明，阿魏酸能通过抑制GSK-3β的磷酸化来保护链脲佐菌素诱导的糖尿病大鼠的心脏组织[19]。本研究也证实了阿魏酸能抑制SH-APP细胞中GSK-3βY216位点的磷酸化，鉴于有证据表明磷酸化的tau蛋白可导致微管不稳定，轴突运输受损并最终导致神经元死亡，通常认为抑制tau磷酸化可能是治疗或预防AD的有效策略。Western blot 结果显示阿魏酸可以显著降低SH-APP细胞中tau蛋白Ser 396和Ser 199/202残基位点的磷酸化，而该残基位点是GSK-3β的靶标，并且与AD脑中的PHF缠结有关[20-21]。因此，阿魏酸可以通过激活GSK-3β激酶途径调节tau蛋白上多个AD相关位点的磷酸化来发挥抗AD的作用。

APP和早老素基因中的一些突变与Aβ产生的增强有关[22]，并且与细胞死亡的易感性增加有关[23]。此外，APP也是caspase-3剪切的底物，几项研究表明，caspase介导的APP剪切改变了其正常的蛋白水解过程，从而促进了淀粉样蛋白生成途径，提示caspase-3介导了APP毒性片段的扩大[23-25]。在本研究中，我们发现阿魏酸能抑制SH-APP细胞中的caspase-3/7活性。同时，流式细胞检测也证实了阿魏酸具有抗细胞凋亡作用。此外，阿魏酸处理能使SH-APP细胞中剪切的caspase-9的表达下调，这些结果与先前的研究一致，即阿魏酸可以降低caspase介导的APP的异常剪切，并且降低多种AD模型中的细胞凋亡率，从而发挥抗AD的作用。

Morris 水迷宫可检测啮齿类动物空间学习和空间记忆能力，是学习记忆方面最为经典的实验方法，在AD 的研究中应用较为广泛[26]。在本次定位航行实验中，AD模型组的逃避潜伏期均比假手术组及正常组长，而阿魏酸给药后大鼠的学习记忆能力得到提高。其次，在空间探索实验中，也得到类似结果，提示阿魏酸对Aβ诱导的AD大鼠在Morris水迷宫中的行为学方面是有明显保护作用的。

综上所述，阿魏酸在体外建立的APP过表达的AD细胞模型中具有显著的抗AD作用，且能显著改善Aβ所致AD模型大鼠行为学特征，可能在治疗这种复杂的神经退行性疾病中具有一定的优势，成为AD治疗中具有价值的候选药物。