注射用复合辅酶渗透压摩尔浓度考察与肌肉刺激实验研究

吴森，吕晓君*，韩玮，王平慧，杨雅婷，周大庆，沈佳特（1.湖北省药品监督检验研究院，武汉 430064；2.湖北省药品质量检测与控制工程技术研究中心，武汉 430064）

注射用复合辅酶能提高机体的免疫力，在临床上主要用于急、慢性肝炎，原发性血小板减少性紫癜，放化疗所引起的白细胞和血小板降低症；对冠状动脉硬化、慢性动脉炎、心肌梗死、肾功能不全引起的少尿、尿毒症等有一定的辅助治疗作用[1]。注射用复合辅酶是含有辅酶A、辅酶I、三磷酸腺苷、还原型谷胱甘肽和核苷酸等多种辅酶和生物活性物质的复合物，由新鲜食用酵母为原料提取精制所得。该品种现行质量标准为国家食品药品监管局国家药品标准WSXG-010-2002-2006，除了标准中规定的不溶性微粒、无菌、热原、异常毒性检查项目外，渗透压摩尔浓度和肌肉刺激性也是注射剂类药品质量控制和临床安全使用的重要指标[2-5]。在注射用复合辅酶说明书中，静脉滴注时加入5%葡萄糖注射液稀释溶解，肌内注射时用1、2 mL 0.9%氯化钠注射液溶解，因此本研究用两种溶媒配制成供试品溶液，依据《中国药典》2015年版四部方法考察了32批注射用复合辅酶的渗透压摩尔浓度[6]；并参照《药物刺激性、过敏性和溶血性研究技术指导原则》的要求对4批注射用复合辅酶进行肌肉刺激研究[7]，评价其安全性，为该品种的质量控制和临床用药安全提供实验数据。

1 材料

1.1 试药与仪器

注射用复合辅酶32批（北京双鹭药业股份有限公司，样品序号、批号、规格见表1）。渗透压摩尔浓度测定标准溶液（规格：100 mOsmol·kg-1，批号：OSM10016K1；500 mOsmol·kg-1，批号：OSM50017E1，爱尔兰Reagecon公司）；0.9%氯化钠注射液（规格：100 mL/瓶，批号：1809230504，武汉滨湖双鹤药业有限责任公司）；5%葡萄糖注射液（规格：100 mL/袋，批号：WB1704006，湖北华仁同济药业有限责任公司）；SMC-30C型渗透压测定仪（天津天河医疗仪器有限公司）。

表1 注射用复合辅酶样品信息表 Tab 1 Sample information of coenzyme complex for injection

1.2 实验动物

日本大耳白兔，普通级，24只，雌雄不限，体质量为2.5～2.9 kg [生产许可证：SCXK（鄂）2016-0011，武汉市万千佳兴生物科技有限公司]。饲养于湖北省药品监督检验研究院，饲养条件：普通级环境，自由饮用净化水，光照为12 h明暗交替，温度为18～26℃，相对湿度40%～70%。实验动物使用许可证：SYXK（鄂）2019-0009。

2 方法

2.1 渗透压摩尔浓度考察

32批注射用复合辅酶选用5%葡萄糖注射液和0.9%氯化钠注射液两种溶媒制备供试品溶液溶解。在临床静脉滴注的体积最小为50 mL，因此取供试品1 支，加50 mL 5%葡萄糖注射液溶解，摇匀；另取供试品2支，每支分别用1 mL和2 mL 0.9%氯化钠注射液溶解，摇匀。将制备好的供试液依照《中国药典》2015年版四部通则0632渗透压摩尔浓度测定法检测[6]，取3次测定结果的平均值作为测定结果。

2.2 肌肉刺激实验

选取4批注射用复合辅酶（序号为1、8、13、15），每批供试品分别加0.9%氯化钠注射液1 mL和2 mL充分混匀溶解，得供试品高剂量溶液和供试品低剂量溶液。24只家兔随机分成8组，分别为4批供试品的高、低剂量组，每组3只。电推剪去两侧股四头肌给药部位的兔毛，消毒皮肤后，采用同体左右侧自身对比法，家兔左侧股四头肌给予供试品溶液，右侧股四头肌给予 0.9%氯化钠注射液（阴性对照）。每侧注射体积均为1 mL，单次给药。于给药后48 h，家兔由耳缘静脉注入空气栓塞处死，切开皮肤，钝性分离避免机械损伤肌肉，轻柔取出股四头肌，纵向切开，肉眼观察肌肉组织，记录其颜色、光泽，有无充血、水肿、变性或坏死等大体改变，并取两侧注射部位肌肉组织进行组织病理学检查。按表2计算相应的反应级，计算平均值，根据表3计算肌肉刺激性总反应级，判定刺激等级，并结合组织病理学检查的结果进行综合评价。

表2 肌肉刺激反应分级标准 Tab 2 Classification standard for muscle stimulation responses

表3 肌肉刺激反应平均分值和等级 Tab 3 Average score and grade of muscle stimulation response

3 结果

3.1 渗透压摩尔浓度

渗透压摩尔浓度结果见表4。注射用复合辅酶在用50 mL 50%葡萄糖注射液溶解时，32批供试品溶液的渗透压摩尔浓度为277～321 mOsmol·kg-1，且不同规格的供试品无明显差异；在用1 mL和2 mL 0.9%氯化钠注射液溶解时，不同浓度的注射用复合辅酶溶液差别较大，且与剂量相关，均大于正常人体血液的渗透压摩尔浓度（285～310 mOsmol·kg-1）[8]。

表4 注射用复合辅酶渗透压摩尔浓度测定结果 Tab 4 Osmolarity of coenzyme complex solution

3.2 肌肉刺激实验

3.2.1 肉眼观察及评分结果 家兔肌内注射给药48 h后，阴性对照组家兔肌肉组织未见异常（见图1A），无肌肉刺激反应。注射用复合辅酶溶液在给药后48 h，家兔肌肉组织出现出血、充血或坏死等不同程度的肌肉刺激反应（见图1B～1I），说明注射用复合辅酶对家兔的肌肉刺激反应程度与给药浓度有关。肌肉刺激评分结果见表5。

表5 家兔给药后48 h肌肉刺激反应积分和分级(n＝3) Tab 5 Score and grade of muscle stimulation response at 48 h after the administration in rabbits (n＝3)

图1 家兔给药后48 h肌肉刺激肉眼观察结果Fig 1 Muscle stimulation by macroscope at 48 h after the administration in rabbits

3.2.2 组织病理学检查结果 家兔肌内注射给药后48 h肌肉组织病理学检查结果如图2所示。阴性对照组的给药部位肌纤维组织结构完整，无变性、坏死，未见炎细胞浸润现象（见图2A）。注射用复合辅酶用0.9%氯化钠注射液配制的供试品溶液在给药后48 h后家兔注射部位肌肉组织出现不同程度的组织病理学改变，200单位的供试品高剂量溶液组家兔注射部位肌肉组织出现血管扩张淤血、出血伴血栓形成、大量炎性细胞浸润、肌纤维大面积坏死（见图2B～2D），低剂量溶液组家兔注射部位肌肉组织出现不同程度的血管扩张淤血、红细胞少量渗出、少量炎性细胞浸润，病变性质及程度低于高剂量组（见图2E及2F）；100单位的供试品高剂量溶液组家兔注射部位肌肉组织出现血管轻度扩张淤血、轻度至中度出血，未见变性坏死、炎性细胞浸润（见图2G及2H），低剂量溶液组家兔注射部位肌肉组织未见明显异常（见图2I及2J）。

4 讨论

4.1 注射用复合辅酶不同给药途径时的渗透压摩尔浓度

在溶质的扩散和通过生物膜的转运过程中，渗透压摩尔浓度起着极其重要的作用。注射剂、眼用制剂因其用药部位特殊，因此在制备中必须关注其渗透压。注射用复合辅酶在现行标准中，对渗透压摩尔浓度检查项目未进行规定和控制，可能导致该厂家生产的样品渗透压摩尔浓度过高或者过低而影响临床使用，也可能导致不同批号、不同规格的样品间渗透压摩尔浓度值存在差别。注射用复合辅酶在使用说明书上的用法有两种：加入5%葡萄糖注射液内稀释后静脉滴注或用1、2 mL 0.9%氯化钠注射液溶解后肌内注射，因此本研究考察了不同批次、两种规格的32批样品用两种不同溶剂稀释后的渗透压摩尔浓度。

本品在静脉滴注时，采用5%葡萄糖注射液进行稀释。5%葡萄糖溶液的渗透压摩尔浓度与人体血液相当，为等渗剂。注射用复合辅酶被大量等渗剂稀释，可使药物自身的渗透压摩尔浓度值大大降低，但说明书中未对稀释溶剂（5%葡萄糖注射液）的体积进行规定或说明。溶剂的体积不同，对药物自身渗透压摩尔浓度值的降低程度不同，体积越大，对渗透压摩尔浓度值的降低程度越大，进入人体时渗透压摩尔浓度值越接近等渗值。临床使用5%葡萄糖注射液最大体积有500 mL，最小体积为50 mL，当稀释溶液体积不够大时，存在安全风险。因此5%葡萄糖注射液选用最小体积50 mL来稀释样品，结果显示，注射用复合辅酶的渗透压摩尔浓度范围为277～321 mOsmol·kg-1，接近正常人体血液的渗透压摩尔浓度值。不同批次间、不同规格间的差异较小，说明在生产过程中对该品种对静脉滴注的渗透压值控制较好。

本品在肌内注射时，结果显示渗透压摩尔浓度值范围为603～1737 mOsmol·kg-1。正常人体液（包括血浆、组织液）渗透压摩尔浓度均值为298 mOsmol·kg-1[8]，人体可承受140～830 mOsmol·kg-1的渗透压[9]。本实验中用 1 mL或2 mL0.9%氯化钠注射液进行溶解的32批供试品的渗透压摩尔浓度值均大于人体液的正常渗透压摩尔浓度均值，其中5批规格为200单位的供试品分别用1 mL或2 mL溶解、27批规格为100单位的供试品用1 mL溶解时的渗透压摩尔浓度远大于正常人体可承受的渗透压摩尔浓度值上限。

4.2 注射用复合辅酶的肌肉刺激性

本实验考察了两种规格4批次注射用复合辅酶对家兔进行单次给药的肌肉刺激作用。结果显示注射用复合辅酶呈现剂量关系的肌肉刺激反应，200单位规格的注射用复合辅酶用1 mL和2 mL 0.9%氯化钠注射液制备的溶液为轻度至重度的肌肉刺激性，100单位规格的注射用复合辅酶用1 mL 0.9%氯化钠注射液制备的溶液为轻度肌肉刺激性。表明注射用复合辅酶的肌肉刺激性与渗透压摩尔浓度成正相关，渗透压摩尔浓度越高，对家兔的肌肉刺激性越大，在人体可承受的范围内时表现为无刺激性。

静脉注射剂进入人体血液中，其渗透压摩尔浓度值必须与人体血浆渗透压基本保持一致，过高或过低都会对人体产生不良反应，引起病理损害。大量输入低渗溶液可能导致机体血红细胞肿胀变形破裂造成溶血，大量输入高渗溶液可能会造成血管栓塞。本品在静脉注射时的渗透压摩尔浓度接近正常人体，控制较好；但在肌内注射时，用1 mL 0.9%氯化钠注射液溶解后的渗透压摩尔浓度值过高，可能会对局部组织细胞产生强烈的刺激作用，引起剧烈疼痛，使用时就会增大其肌肉刺激性。因此建议说明书中的用于肌内注射的样品修改为用2 mL0.9%氯化钠注射液溶解。

综上所述，注射用复合辅酶用于肌内注射有一定程度的肌肉刺激性，可能与其渗透压摩尔浓度有关。本次研究的结果可以为注射用复合辅酶的临床合理用药提供。