克服顺铂耐药性的新型Pt（Ⅳ）前药研究进展

孙蒙琪，陈西敬，赵娣（中国药科大学基础医学与临床药学学院，南京 210009）

自1965年铂电极被发现能够抑制细菌生长以来[1]，铂类药物得到了极大的发展。1978年，顺铂问世[2]。在之后的几十年中，顺铂、卡铂、奥沙利铂等经典Pt（Ⅱ）药物广泛应用于国内外的临床一线，超过50%的实体瘤都采用了铂类药物治疗方案[3-4]。目前普遍认为顺铂通过主动转运[铜离子转运体1（copper transporter 1，CTR1）]和被动扩散两种方式进入细胞，在进入细胞后顺铂被水解活化，活化后的顺铂会与DNA的N7处鸟嘌呤结合，使得DNA不能进行正常的复制和转录，进而引起细胞凋亡，从而达到治疗的目的[5]。

尽管铂类药物在肿瘤治疗中有着重要的地位，但是其严重的毒副作用和不可避免的耐药性限制了其临床进一步应用。目前研究表明，Pt（Ⅱ）化合物可引起包括耳毒性、肾毒性、神经毒性和血液毒性等在内的毒副作用[6-9]，患者往往因为毒性明显而不得不中断治疗。除了毒副作用，耐药性（先天性耐药和获得性耐药）也是不可忽视的问题之一。基于此，研究人员期望通过开发新型铂类药物来克服耐药问题，因而Pt（Ⅳ）前药得到了广泛的关注。Pt（Ⅳ）前药是在Pt（Ⅱ）化合物的基础上，在轴向位置添加功能或非功能配体，形成与Pt（Ⅱ）化合物不同的低自旋八面体结构，使其在体内不易发生取代反应，进而减少了Pt（Ⅱ）化合物在到达靶DNA之前与生物分子过早反应而失效问题的发生，并且在一定程度上降低了毒副作用[10-11]。通常认为，Pt（Ⅳ）前药的中心铂原子处于相对惰性的四价氧化态，前药在细胞中被还原物质激活而释放出轴向配体，同时生成对应的有活性的Pt（Ⅱ）化合物而发挥药效。这些细胞内的还原物质主要包括抗坏血酸、半胱氨酸、谷胱甘肽（glutathione，GSH）和其他大分子[12-13]。Pt（Ⅳ）前药的两个配体可以对化合物的理化性质进行一定的调整，包括亲脂性、氧化还原电位和靶向性等，以期能够增强药物的活性并且克服顺铂耐药性[14]。尽管对Pt（Ⅳ）前药的设计研发日益增加，但是目前仍未有Pt（Ⅳ）前药获批上市。因此，本文概括了顺铂耐药发生的机制以及目前设计合成的能够克服顺铂耐药的新型Pt（Ⅳ）前药，以期为后续Pt（Ⅳ）前药的设计开发提供借鉴。

1 顺铂耐药机制研究现状

近年来，顺铂在肿瘤中的耐药机制得到了广泛的研究。顺铂耐药的产生通常涉及到达靶DNA前的药物转运和代谢过程、DNA损伤修复过程以及基因组表观遗传发生变化等[15-17]（见图1）。CTR1在细胞摄取顺铂的过程中发挥着重要的作用，而其下调与铂类药物耐药性的产生密切相关[18-19]。顺铂被细胞摄取后，并不意味着其可以顺利与DNA结合而发挥药效，肿瘤细胞内高表达的亲核物质（如GSH、金属硫蛋白）会与顺铂结合而使其失活，随后顺铂与GSH的结合物由多药耐药相关蛋白2（multidrug resistanceassociated protein 2，MRP2）转运排出细胞[20]。而一些未结合的顺铂则可能由铜转运P型ATP酶（ATP7A和ATP7B）转运排出细胞，ATP7A和ATP7B的过表达也成为细胞对顺铂耐药的诱因之一[21]。也有研究表明铜离子转运蛋白2（copper transporter 2，CTR2）和有机阳离子转运体2（organic cation transporter 2，OCT2）与经顺铂治疗后的癌症患者的疗效和预后有关[22-23]，但是其参与细胞产生顺铂耐药的机制仍有待探索，有研究发现在肺癌中OCT6下调与顺铂耐药直接相关[24]。不仅仅是转运和代谢的改变会导致顺铂的药效降低。在癌症中，DNA损伤修复反应引起的耐药问题也不容忽视。顺铂诱导产生的DNA损伤主要通过核苷酸切除修复（nucleotide excision repair）、同源重组修复（homologous recombination）和碱基切除修复（base-excision repair）等途径修复，主要涉及但不限于核苷酸切除修复交叉互补组1/2（excision repair cross complementing group 1/2，ERCC1/2）、同源重组修复蛋白RAD51和X射线修复交叉互补基因1（X-ray repair cross complementing 1，XRCC1）等，这些蛋白在大多数顺铂耐药细胞中都出现表达上调的现象[25-27]。

图1 肿瘤细胞中顺铂出现耐药的常见原因Fig 1 Causes of cisplatin resistance in tumor cells

在大多数情况下，耐药机制不止一种，近年来对表观遗传学和肿瘤微环境的研究也为化疗耐药的产生做出了一些新的解释[28]。表观遗传学研究发现，RNA选择性剪接[29]、RNA和DNA高甲基化[30-31]以及凋亡相关蛋白（如BIRC3）的表观遗传学修饰[32]均与顺铂耐药的发生有着密切的关系。而对肿瘤微环境变化的研究也从另一方面对顺铂耐药做出了解释。肿瘤微环境中包括除了肿瘤细胞以外的间充质细胞、免疫细胞及其相关成分等[33]。研究人员发现，间充质细胞表型的变化[34-35]、CD8＋T细胞活性的降低[36]以及CD44、CD117和β-整合素等分子[37]都与顺铂耐药具有一定的相关性。目前研究人员还在对因表观遗传学和肿瘤微环境的变化而使细胞产生顺铂耐药的原因进行更深入的研究，这些研究为寻找更有效的逆转顺铂耐药的策略提供了更多的方向。

2 克服顺铂耐药的Pt（Ⅳ）前药研究现状

2.1 靶向细胞凋亡及DNA损伤修复

2.1.1 细胞凋亡逃逸 p53在调控细胞凋亡以及维持基因组稳定等方面发挥着重要作用，其突变与肿瘤的发生密切相关[38]。在设计能够逆转顺铂耐药的Pt（Ⅳ）前药时，这个靶点也被研究人员考虑在内。在顺铂耐药的人卵巢癌细胞A2780中，Xie等[39]自主合成的Pt（Ⅳ）前药DAP（化合物1，见图2）[40]不仅可以延长p53半衰期，还可以阻止其由活性状态转化为非活性结合状态，从而在体外达到良好的抗肿瘤效果。查尔酮与顺铂结合形成的查尔铂（化合物2，见图2）可以激活p53基因，在A549及顺铂耐药细胞株中均发挥了良好的药效，但是进一步的研究结果显示查尔铂在p53缺失的细胞中并不能提高铂类与DNA的结合率[41]，因而查尔铂具体的药理作用机制仍旧需要进行进一步的探究。以上的研究结果表明以p53为靶点进行Pt（Ⅳ）前药开发具有可能性，但需要进一步在体内进行药理药效探究。除了p53以外，caspase 3以及bcl-2/bax在细胞凋亡中也发挥着重要的作用。研究人员将阿司匹林与顺铂结合而形成的Pt（Ⅳ）前药（化合物3，见图2）在体外可以抑制抗凋亡基因bcl-2的表达，而促进促凋亡基因bax的表达，进而诱导生成更多的caspase3以达到更佳的抗肿瘤效果，但其体内药效还未被验证[42]。

图2 促进细胞凋亡的Pt（Ⅳ）前药Fig 2 Pt（Ⅳ）prodrugs that increase cell apoptosis

2.1.2 DNA损伤修复 DNA损伤修复反应包括核苷酸切除修复、同源重组修复和碱基切除修复等。修复过程涉及多种分子，如共济失调毛细血管扩张突变基因（ataxia telangiectasia-mutated gene，ATM）、XRCC1、检查点激酶1（checkpoint kinase 1，CHK1）、乳腺癌1号基因（breast cancer 1，BRCA1）、酪蛋白激酶2（caseinkinase 2，CK2）、ERCC1和RAD51蛋白等[43-44]，在维持基因组完整性和调节抗肿瘤药物的药效方面具有重要意义。如抑制核苷酸切除修复过程是克服顺铂耐药的策略之一。NERi-Pt（Ⅳ）前药（化合物7，见图3）是在顺铂的轴向位置键合了一种核苷酸切除修复抑制剂（NERi），该前药在进入细胞后会释放出顺铂和NERi，NERi的存在使得顺铂可以与更多的鸟苷酸有效结合，从而发挥更佳的药效。该化合物对顺铂耐药的A549细胞的毒性相较于顺铂提高了约88倍，且与顺铂存在较低的交叉耐药。除此之外，NERi-Pt（Ⅳ）前药的耐药因子仅为1.1，表明NERi-Pt（Ⅳ）前药几乎不产生耐药性[45]。同源重组修复在DNA损伤修复反应中也发挥了重要的作用。郭子建课题组设计合成了同时靶向同源修复相关基因RAD51和BRCA1及细胞凋亡基因MCL1的Pt（Ⅳ）前药（化合物8和9，见图3），两Pt（Ⅳ）前药对顺铂耐药的卵巢癌和非小细胞肺癌具有良好的治疗效果，体内荷瘤鼠肿瘤抑制实验结果显示肿瘤的体积减少了80%以上，不仅如此，两Pt（Ⅳ）前药还表现出更低的毒性[46]。苟少华课题组将生物素与Pt（Ⅱ）化合物相连进而形成多功能Pt（Ⅳ）前药（化合物4，见图3），该化合物有效抑制了同源重组修复基因RAD51和非同源末端连接基因Ku70的表达，对顺铂耐药细胞表现出良好的细胞毒性作用。同时，该化合物利用生物素可以被恶性肿瘤表面的生物素特异性亲和蛋白结合并摄取的特性，使其更多地靶向肿瘤细胞，这在一定程度上降低了铂类化合物的全身毒性[47]。除此之外，碱基切除修复通路JWA-XRCC1也被当作靶点来设计合成逆转顺铂耐药的Pt（Ⅳ）前药（化合物5和6，见图3），其对A2780顺铂耐药细胞的毒性相较于顺铂提高了10倍左右。DNA损伤修复能力评价的实验结果表明，与顺铂相比，使用该Pt（Ⅳ）前药的细胞DNA修复能力明显降低。体内肿瘤抑制实验的抑瘤率也达到60%[48]，展现出较好的体内药效。虽然DNA损伤修复的途径很多，但是市面上针对该途径的抗肿瘤药物较少，将参与DNA损伤修复相关基因或蛋白为靶点进行Pt（Ⅳ）前药的设计开发是一种很有希望克服顺铂耐药的策略。

图3 抑制DNA损伤修复的Pt（Ⅳ）前药Fig 3 Pt（Ⅳ）prodrugs inhibited DNA damage repair

2.2 靶向组蛋白去乙酰化酶

组蛋白去乙酰化酶（histone deacelytase，HDAC）对基因的表达调控发挥了重要作用，其通过催化组蛋白尾部赖氨酸残基去乙酰化而抑制转录的进行[49]，有研究表明HDAC的表达增加会诱导顺铂耐药的产生[50]。目前顺铂与HDAC抑制剂的联合治疗已经展现出逆转顺铂耐药的效果[51]。基于此，开发含HDAC抑制剂的单靶向或多靶向作用的Pt（Ⅳ）前药也成为研发的热点，这些Pt（Ⅳ）前药（化合物10～14，见图4）在不同的细胞系中均展现出远优于顺铂的细胞毒性，尤其在耐药细胞系中表现出良好的细胞杀伤作用。除此之外，在进行HDAC活性、细胞凋亡、DNA损伤情况等实验探究时，含HDAC抑制的Pt（Ⅳ）前药也表现出较好的效果。这可能是由于HDAC抑制剂可以使更多的核DNA与铂类药物作用，从而提高铂类药物的疗效[52-54]。但是对于含HDAC抑制剂的Pt（Ⅳ）前药的开发也需要进行综合评估，它们在体内是否同样能够拥有令人满意的药效以及其药效是否会优于联合用药的效果需要进一步探究。

图4 靶向HDAC的Pt（Ⅳ）前药Fig 4 Pt（Ⅳ）prodrugs targeting HDAC

2.3 靶向顺铂代谢

顺铂进入细胞后，会与GSH结合失去药效，继而被转运体转出细胞[55]。谷胱甘肽-S-转移酶（glutathioneS-transferase，GSTs）是GSH合 成过程中的关键酶，其高表达已被证明与顺铂耐药的产生相关[56]。抑制GSTs的活性可以减少GSH合成，进而减少铂类的代谢失活。GSTs抑制剂与顺铂结合形成的Pt（Ⅳ）前药（化合物15，见图5）可以在细胞内稳定释放GSTs抑制剂，从而减少细胞内GSH的含量，其体外疗效远优于顺铂，IC50值仅为0.45 μmol·L-1（顺铂为7.65 μmol·L-1）。同时，实验结果显示该Pt（Ⅳ）前药还可以阻止肿瘤细胞的迁移和侵袭[57]。这表明，在肿瘤产生了顺铂耐药的情况下减少GSH对顺铂的解毒作用有望提高药物治疗指数，但其体内效果需要进一步验证。

图5 靶向GSTs的Pt（Ⅳ）前药Fig 5 Pt（Ⅳ）prodrugs targeting GSTs

2.4 改变Pt（Ⅳ）前药的摄取过程

顺铂在肿瘤细胞中的积累减少是导致患者产生顺铂耐药的关键原因之一。由于顺铂脂溶性较差，因而CTR1对顺铂的转运在细胞对顺铂的摄取过程中有着重要的贡献。但在耐药细胞中，CTR1表达水平明显降低，耐药细胞中顺铂的摄取总量显著降低，进而使顺铂无法发挥药效[13]。基于此，提高Pt（Ⅳ）前药的脂溶性可以增加耐药细胞对其摄取量，有希望克服顺铂耐药。以辛酸酯为轴向配体的双辛酸Pt（Ⅳ）前药（化合物16，见图6）就在一定程度上增加了化合物的脂溶性，化合物16在顺铂敏感和耐药的卵巢癌细胞中的IC50仅为顺铂的6%和3%，在体外展示了良好的肿瘤细胞杀伤效果。在转运方式的探究中，与正常细胞相比，在CTR1表达沉默的卵巢癌细胞中，顺铂的摄取减少了30%，而化合物16的摄取没有显著差异，这表明化合物16的摄取不依赖于CTR1而可能更多地依赖于其脂溶性的提高，摄取的增加提高了化合物16的药效[58]。除此之外，含有苯基侧链的Pt（Ⅳ）前药（化合物17）也展现出良好的治疗效果，其具有较高的亲脂性和相对较低的还原性，在体外展现出很好的抗肿瘤作用。在结肠癌模型小鼠中，化合物17以灌胃的方式给药后可以显著减小肿瘤体积，疗效甚至优于先前已经进入临床试验的赛特铂。这可能是由于该化合物在灌胃给药后结肠药物浓度更高而使细胞摄取更多。这也提示研究人员含有苯基侧链的Pt（Ⅳ）前体药物有望被开发为用于治疗结直肠癌的口服Pt（Ⅳ）前体药物[59]。上述结果可以看出，烷基链或苯基侧链的引入能够增加化合物的脂溶性并改变Pt（Ⅳ）前药的细胞摄取方式，这种改变提高了铂类药物的细胞摄取，但是需要综合评估这种没有选择性的细胞摄取增加是否会对其他正常细胞产生较大毒性的问题。

图6 提高脂溶性的Pt（Ⅳ）前药Fig 6 Pt（Ⅳ）prodrugs improved fat solubility

2.5 提高Pt（Ⅳ）前药的靶向性

肿瘤细胞与正常细胞的代谢方式不同，其细胞膜表面蛋白的表达也有所不同。因此除了增加脂溶性，增加膜蛋白（如葡萄糖转运蛋白、谷氨酰胺转运蛋白等）靶向基团也是一种设计方向。根据“瓦伯格效应”，研究人员将六碳糖、五碳糖或糖类似物与顺铂或奥沙利铂连接形成新的Pt（Ⅳ）前药（化合物18、19、20，见图7），这些Pt（Ⅳ）前药可以被葡萄糖转运体转运，在体外虽表现出较好的效果，但是体内药效不尽如人意[60-62]。同样，利用“第二瓦伯格效应”将谷氨酰胺及其类似物与顺铂连接形成Pt（Ⅳ）前药，谷氨酰胺为配体的Pt（Ⅳ）前药（化合物21，见图7）虽然在转运过程中表现出靶向性，但是其药效没有明显的提高。而谷氨酰胺类似物为配体的Pt（Ⅳ）前药（化合物22，见图7）表现出较好的药效，但是其药效的发挥更多是依赖于化合物脂溶性的提高而非靶向转运[63]。因此，虽然设计开发靶向细胞膜蛋白转运的Pt（Ⅳ）前药是一种合理的设想，但是目前的实验结果并不能达到令人满意的效果。究竟是设计方向本身的问题还是未寻找到更佳的配体仍需要进一步探究。

图7 靶向葡糖糖转运体的Pt（Ⅳ）前药（18、19、20）及靶向谷氨酰胺受体的Pt（Ⅳ）前药（21、22）Fig 7 Pt（Ⅳ）prodrugs targeting glucose transporters（18，19，and 20）and Pt（Ⅳ）prodrugs targeting glutamine receptors（21 and 22）

人血清白蛋白（human serum albumin，HSA）是循环系统中最丰富的蛋白质之一，在多种内、外源性物质的运输、分布和代谢中发挥关键作用[64]。研究人员也对能够与HSA结合的Pt（Ⅳ）前药的开发进行了尝试。在体内，Pt（Ⅳ）前药与HSA结合，结合物可以延长Pt（Ⅳ）前药在体内的循环时间，同时利用肿瘤细胞营养需求增加而胞吞率提高和肿瘤的高通透性和滞留效应（enhanced permeability and retention effect，EPR），可使到达肿瘤细胞的Pt（Ⅳ）前药总量增加而提高药效[65]。十六烷基链是可以与HSA有效结合的基团，将十六烷基链与顺铂化学键合后形成的Pt（Ⅳ）前药（化合物23，见图8）在顺铂耐药卵巢癌细胞中的细胞毒性增加了60倍左右并诱导产生了更多的细胞凋亡。与此同时，研究人员通过计算机分子对接和体外亲和力实验对该Pt（Ⅳ）前药与HSA的结合能力进行了验证，结果显示该Pt（Ⅳ）前药可以与HSA紧密结合。而后续的体外透析实验结果显示90%的Pt（Ⅳ）前药可以从其与HSA的结合物中释放。但是该Pt（Ⅳ）前药的体内药效仍需要进一步探究[66]。

图8 与HAS结合的Pt（Ⅳ）前药Fig 8 Pt（Ⅳ）prodrug combined with HSA

除了合成新的Pt（Ⅳ）前药，不同制剂也是改变铂类药物转运方式的策略之一。纳米制剂通常是研究人员的首选，它通过胞吞的方式进入细胞，在顺铂耐药的细胞中不受CTR1下调的影响。同时配合EPR效应，能够使得纳米颗粒包裹的Pt（Ⅳ）前药有效地运送到肿瘤细胞中，从而提高药物的疗效并克服耐药性。已经有不少纳米载体-Pt（Ⅳ）前药在体外表现出良好的效果，其作用靶点也是多种多样的[67-68]。具有光激活特性的携带Pt（Ⅳ）前药的HSA纳米载体系统对A2780敏感株和耐药株的凋亡诱导能力也均有所增强。但是该研究还未进行体内疗效的验证[69]。除此之外，研究人员也尝试利用纳米制剂的方式减少细胞内GSH的含量来避免铂类的代谢性失活。二硫酰胺中二硫键可以结合GSH，利用这种原理设计的纳米颗粒可以诱导顺铂耐药的卵巢癌细胞出现明显凋亡。体内药效结果显示该纳米颗粒能有效抑制顺铂耐药异种移植瘤的生长，抑瘤率可达到83.32%[70]。

3 结语

虽然顺铂在临床上已经使用了40多年，但其非靶向性和获得性/固有耐药严重限制了临床应用。耐药产生的原因是多方面的，除了细胞转运和代谢导致的顺铂药效降低，表观遗传学和肿瘤微环境的变化也是肿瘤对顺铂产生耐药的原因。Pt（Ⅳ）前药通过一系列配体修饰来改变药物转运、增加药物的肿瘤细胞靶向性、改变药物代谢途径或与其他耐药靶点基团发生作用，从而发挥药效，克服顺铂耐药（见表1）。除此之外，纳米系统的应用也为逆转顺铂耐药的Pt（Ⅳ）前药的开发提供了更多的可能。从目前的研究情况来看，以抑制DNA损伤修复反应为初衷设计合成的Pt（Ⅳ）前药展现出了良好的效果。而以改变药物转运或增加药物的靶向性为目的合成的Pt（Ⅳ）前药虽然数量较多，但大都没有展现出预期的药效。在其他类型的化合物研发中，以表观遗传学和肿瘤微环境中的相关分子为靶点设计开发更有效的抗肿瘤药物已经受到越来越多的重视，而这样设计开发的Pt（Ⅳ）前药还相对较少。随着对肿瘤细胞产生顺铂耐药原因的深入研究，以表观遗传学和肿瘤微环境中的相关分子为靶点设计开发能够逆转顺铂耐药的Pt（Ⅳ）前药也应该受到更多的关注。除此之外，虽然目前已有许多的Pt（Ⅳ）前药被合成出来，但是对他们的研究大部分只停留在体外水平，缺少后续的体内药效和安全性评价。

表1 不同种类逆转顺铂耐药的Pt (Ⅳ)前药 Tab 1 Different Pt (Ⅳ) prodrugs reversing cisplatin resistance

本文基于顺铂耐药的不同分子机制，从多种途径提供了克服顺铂耐药Pt（Ⅳ）前药的设计策略，以期能够为未来逆转耐药Pt（Ⅳ）前药的设计和开发提供一定的借鉴。