UPLC-PDA测定胆木中异长春花苷内酰胺含量

侯倩煜，李飞宇，陈燕艳，杨美华，赵祥升*（.中国医学科学院药用植物研究所海南分所，海南省南药资源保护与开发重点实验室，海口 5703；.中国医学科学院＆北京协和医学院药用植物研究所，北京 0093）

胆木为茜草科乌檀属乔木乌檀（Nauclea officinalisPierrc ex Pitard）的干燥茎、枝、树皮和根，又称乌檀、药乌檀、黄羊木、熊胆树、山熊胆等，是一味常用的黎药，收载于《黎族医药》[1-2]。胆木生于高山近顶或半山腰荫蔽潮湿地带的杂木林中，分布狭窄且种群数量少，为中海拔森林中少见的乔木树种，主要分布于广东、广西和海南等地，为我国重点保护的珍稀野生植物物种，也是海南省珍贵的南药树种[3-4]。胆木味苦、性寒，全株可入药，具有消炎杀菌、清热解毒、消肿止痛之功效，我国南方民间常用于治疗感冒发热、肺炎、肠炎、胆囊炎、痢疾、湿疹、皮疹、泌尿系统感染、脓疡等病症，外用于痈疖脓肿[2-3]。国内临床目前有胆木注射液、胆木浸膏糖浆和胆木浸膏胶囊等中药制剂，主要用于急性扁桃腺炎、急性咽喉炎、急性结膜炎及上呼吸道感染等，疗效良好[4]。

胆木中主要有效成分为吲哚类生物碱，其主要为异长春花苷内酰胺。异长春花苷内酰胺（isovincoside lactone，又名strictosamide）具有抗肿瘤、杀疟原虫等活性，是胆木中药制剂中的主要有效成分，含量较高，是评价胆木注射液、胆木浸膏糖浆和胆木浸膏胶囊质量的指标成分[5-7]。目前，文献多采用高效液相色谱法测定胆木中药制剂中异长春花苷内酰胺含量，但对胆木生药中该成分的含量测定相对较少，且文献中报道主要用药部位为茎、枝[8]，根、皮和叶的研究较少。为充分利用胆木资源，需探索胆木其他部位异长春花苷内酰胺含量，挖掘胆木新的药用部位。本文采用超高效液相色谱法（UPLC）对胆木的根、枝、皮、叶中异长春花苷内酰胺含量进行测定，并比较各部位含量高低，探讨采集地区、部位、月份、树龄对胆木中异长春花苷内酰胺含量的影响，以期为胆木药材的质量控制提供参考。

1 材料

1.1 仪器

Waters H-class型超高效液相色谱仪（美国Waters公司，带PDA检测器）；XS105DU型十万分之一电子天平、LE203E型千分之一电子天平（上海托利多有限公司）；KQ-500DE型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；GL-21B型低温高速离心机（上海安亭科学仪器厂）；BJ-800A型多功能粉碎机（上海拜杰实业有限公司）；Mili-Q型纯水仪（美国Millipore公司）。

1.2 试药

胆木采自海南省五指山、琼中等地，经中国医学科学院药用植物研究所海南分所南药研究中心鉴定为茜草科乌檀属乔木乌檀Nauclea officinalisPierrc ex Pitard的枝、树皮、根和叶。异长春花苷内酰胺对照品（中国食品药品检定研究院，纯度＞98%，批号：111778-202003）。色谱纯的甲醇、乙腈、甲酸、乙酸（Fisher公司）。

2 方法与结果

2.1 对照品储备液的制备

精密称取异长春花苷内酰胺对照品适量，置于5.0 mL的棕色量瓶中，75%甲醇溶解并定容至刻度，配成质量浓度为1070 μg·mL-1的对照品储备液，4℃保存，备用。不同质量浓度的对照品溶液由储备液稀释得到。

2.2 供试品溶液的制备

称取胆木药材粉末（过二号筛）0.10 g，加入75%甲醇40 mL，称重，超声提取45 min（功率500 W，频率40 kHz），冷却至室温，用75%甲醇补足减失的重量，离心10 min（3000 r·min-1），取上清液，过0.22 μm微孔滤膜，即得供试品溶液。

2.3 色谱条件

色谱柱：Waters BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流动相：乙腈（A）-纯水（B），梯度洗脱（0～7 min，20%～40%A）；流速为0.4 mL·min-1；柱温为40℃；进样量为3 μL；检测波长为227 nm。在该条件下，对照品及胆木样品的色谱图见图1。

图1 对照品（A）和胆木根（B）、叶（C）、枝（D）、皮（E）样品的UPLC色谱图Fig 1 UPLC chromatogram of the reference substance（A）and root（B），leaf（C），branch（D）and bark（E） of Nauclea officinalis Pierrc ex Pitard 1.异长春花苷内酰胺（isovincoside lactone）

2.4 方法学考察

2.4.1 线性关系、检测限与定量限 异长春花苷内酰胺对照品储备液用75%甲醇稀释为不同质量浓度的对照品溶液，0.22 μm微孔滤膜过滤，按“2.3”项下色谱条件测定，记录峰面积。以进样质量浓度（X，μg·mL-1）为横坐标，峰面积（Y）为纵坐标进行线性回归，得标准曲线Y＝5.298×104X＋3.947×104（R2＝0.9991），线性范围为0.11～85.60 μg·mL-1。取异长春花苷内酰胺对照品储备液，用75%甲醇逐级稀释，测定异长春花苷内酰胺检测限（S/N＝3）和定量限（S/N＝10）分别为53.5 ng·mL-1和107.0 ng·mL-1。

2.4.2 精密度、稳定性、重复性 取异长春花苷内酰胺质量浓度为5.35 μg·mL-1的对照品溶液，连续进样6次，计算得异长春花苷内酰胺色谱峰峰面积的RSD为0.98%，表明仪器精密度良好。取同一批胆木（S13）粉末6份，按“2.2”项下方法制备供试品溶液并进样测定，记录峰面积。计算得异长春花苷内酰胺的平均含量为3.132 mg·g-1，RSD为1.2%，表明该方法重复性良好。取同一供试品溶液，分别于0、2、4、8、12、18、24 h进样测定，计算异长春花苷内酰胺色谱峰峰面积的RSD为0.32%，表明样品在24 h内稳定性良好。

2.4.3 加样回收试验 称取6份已知含量的同一批胆木样品（S13）粉末0.05 g，精密加入适当浓度的对照品溶液（相当于供试药材原有含量质量分数的100%）。按照“2.2”项下方法制备供试品溶液，进样测定，计算加样回收率，结果异长春花苷内酰胺的平均加样回收率（n＝6）为99.77%，RSD为0.13%，表明方法准确可靠。

2.5 样品含量测定

分别取不同编号的胆木药材粉末，依据“2.2”项下方法制备供试品溶液，注入UPLC进行测定，结果见表1。胆木不同部位的异长春花苷内酰胺含量存在差异，根中含量最高（11.42～13.38 mg·g-1），其次为叶（2.03～5.00 mg·g-1），枝中（1.57～3.79 mg·g-1）含量相对较低。该结果在文献报道的胆木异长春花苷内酰胺含量范围内（1.68～19.77 mg·g-1）[8-10]。

表1 胆木样品中异长春花苷内酰胺的含量 Tab 1 Content of isovincoside lactone in Nauclea officinalis Pierrc ex Pitard

此外，不同地区和不同树龄胆木的枝中异长春花苷内酰胺含量存在差异，海南琼中胆木枝中异长春花苷内酰胺含量大于海南五指山（S6～S9），5年生的胆木枝中异长春花苷内酰胺含量大于3年、7年和12年生胆木枝（S8～S12）。采集时间对胆木根和枝样品中的异长春花苷内酰胺含量也存在影响，在5月份采集的胆木根和枝中异长春花苷内酰胺含量大于1、3月份（S13～S18）。由此猜测胆木中异长春花苷内酰胺含量会随地区、植株年龄、采集月份不同等因素发生波动。

3 讨论

试验考察了不同流动相（乙腈-水、乙腈-甲酸水溶液、乙腈-乙酸水溶液）、流速（0.2、0.3、0.4、0.5 mL·min-1）和柱温（30、40、50、60℃）等对目标峰分离度的影响。结果表明，乙腈-水为流动相时分离效果好、保留时间短且基线稳定。流速为0.4 mL·min-1可缩短样品运行时间且柱压适中。温度波动对异长春花苷内酰胺的色谱峰峰面积无较大影响（RSD＝0.62%），本方法优选40℃柱温，分离度和保留时间都较好。UPLC分析结果表明，异长春花苷内酰胺能在227 nm下得到较好吸收，因此，选择227 nm作为检测波长，表观峰度高、峰形较好且基线稳定。

考察了超声提取和回流提取对提取异长春花苷内酰胺含量的影响。结果显示两种方法差异不大，但超声提取简便、快速、适合批量提取。试验中优化了影响目标物超声提取率的因素：提取溶剂（纯水、25%甲醇、50%甲醇、75%甲醇、甲醇），料液比（1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50）和超声时间（30、45、60、90、120 min）等，结果见图2。由图可知，用40 mL 75%甲醇超声提取45 min时，异长春花苷内酰胺的提取效果最好。

图2 提取溶剂、溶剂体积和提取时间对异长春苷内酰胺提取率的影响Fig 2 Effect of extraction solvent，volume of solvent and extraction time on extraction efficiency of isovincoside lactone in the Nauclea officinalis Pierrc ex Pitard.

由于胆木原材料逐渐匮乏，为了更加合理地利用资源，实现可持续发展，需探索胆木各部位的药用价值。异长春花苷内酰胺是胆木中药制剂中主要有效成分，研究结果发现胆木根、茎、皮、叶中皆含有异长春花苷内酰胺，且含量较大，其中胆木根中异长春花苷内酰胺含量较高，但采集树根对胆木树的伤害较大，故不建议根入药，现阶段运用最多的为胆木枝，胆木叶的运用较少。胆木叶中异长春花苷内酰胺含量高于胆木茎，且胆木叶的采收产量较多、对胆木树伤害较小。根据文献报道，胆木叶醇提物（20 g·kg-1）与由胆木茎皮提取的胆木浸膏片（800 mg·kg-1）具有相同的抗炎镇痛作用，胆木叶提取物有抗氧化活性且对耐甲氧西林葡萄球菌具有很好的抑菌效果[11-13]，但胆木叶的毒理学还有待研究。

综上，本研究建立了UPLC测定胆木中异长春花苷内酰胺含量的方法，该方法准确度高，选择性好，具有较好的重复性和精密度，适用于胆木中异长春花苷内酰胺含量定量分析，可为相关检测工作提供参考。