不同剂量包虫病基因工程亚单位疫苗EG95免疫牦牛后的抗体水平测定

李盛琼，杨光友，李徳珍，陈和强，华瑞其，高 露，尹 杰，袁东波，杨天俊，黄雅琳，魏秋霞，阳爱国，侯 巍

（1.四川省动物疫病预防控制中心，四川成都 610041；2.四川农业大学动物医学院，四川成都 611130；3.道孚县动物疫病预防控制中心，四川道孚 626400；4.甘孜州动物疫病预防控制中心，四川甘孜 626700；5.富顺县农业农村局，四川富顺 643200；6.雅安市养殖业发展中心，四川雅安 625000）

包虫病（棘球蚴病）是由细粒棘球绦虫寄生于动物（人）的肝脏、肺脏等器官引起的一种人兽共患病，严重影响我国畜牧业发展和人类健康[1-3]，我国将其列为二类动物疫病进行防控。包虫病主要流行于我国北方和西南地区，其中西南地区主要集中于高海拔农牧区。经济发展相对滞后，基层动物防疫体系薄弱，是造成包虫病流行的主要因素[4]。四川省是牦牛养殖大省，截至2021 年末，全省包虫病疫区县共存栏牦牛420.6 万头，牦牛存栏量大，疫苗需求量也大。为探索更为科学、经济的免疫方案，本研究开展了不同剂量包虫病基因工程疫苗EG95 免疫牦牛的效果试验，使用间接ELISA血清抗体检测方法，评价了不同免疫剂量对牦牛包虫病的保护效果，以期为四川省乃至全国的牦牛包虫病防控提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验动物 选取甘孜州道孚县玉科镇某养殖户1 岁左右未免疫包虫病疫苗牦牛50 头，随机平均分为A、B、C、D、E 5 组，每组10 头，在同等生产条件下进行饲养管理。

1.1.2 试验疫苗 包虫病基因工程疫苗EG95（批号2021007-1），每头份含有EG95 抗原50 μg，购自重庆澳龙生物制品有限公司。

1.1.3 仪器和试剂 96 孔酶标仪，购自Bio-Rad公司；37 ℃恒温培养箱，购自上海福玛实验设备有限公司；微量移液器，购自Transferpette 公司；一次性移液器吸头，购自Axygen 公司；牛棘球蚴（EG95）ELISA 抗体检测试剂盒（批号20211004），购自重庆澳龙生物制品有限公司。

1.2 方法

1.2.1 不同剂量免疫 采取颈部皮下注射方式，分别按照1、2、3、4、5 头份剂量对A、B、C、D、E 5 组试验牦牛进行免疫，间隔28 d 后同等剂量二免。免疫后观察牦牛有无呕吐、抽搐、休克等应激反应和过敏反应，同时监测牦牛的体温变化。首免前及二免后15 d 分别采集试验组牦牛血液分离血清，-20 ℃保存备用。

1.2.2 血清抗体检测 采用间接ELISA 方法对试验血清进行IgG 检测，按照牛棘球蚴（EG95）ELISA 抗体检测试剂盒说明书进行结果判定：当样品OD450nm≤0.3 时，判定为所检样品对细粒棘球蚴（包虫）感染无保护力；当0.3 ＜样品OD450nm≤0.6 时，判定为所检样品抗体水平较低，保护力低下；当样品OD450nm＞0.6 时，判定为所检样品抗体水平较高，有较强保护力。

2 结果与分析

2.1 免疫应激反应

首次免疫后，试验D 组、E 组牦牛在免疫后1 d 分别有1 头牦牛出现精神沉郁、不愿走动、采食量下降等免疫应激症状，免疫部位未发生溃烂，上述2 头牦牛分别在免疫后2、3 d 恢复正常；所有试验牦牛免疫1 周内体温无明显变化，无试验动物死亡情况。

二次免疫后，5 组试验牦牛的呼吸、精神、采食等指标均无明显变化，所有试验组动物免疫1 周内体温无明显波动。

2.2 免疫抗体阳性率

首免前采集5 组试验牦牛的血液进行血清学免疫抗体检测，结果均未检测出包虫病阳性抗体；二免后15 d，再次采集5 组试验动物血液进行免疫抗体检测，发现A、B、C 组牦牛的抗体阳性率分别为30%、40%、50%，与E 组的90%存在显著性差异（P＜0.05），D 组抗体阳性率为80%，与E 组无显著性差异（P＞0.05）。具体检测结果见表1。

表1 牦牛免疫后血清抗体检测结果

2.3 免疫抗体合格率

经检测，E 组有7 头牦牛的样品OD450nm＞0.6，抗体合格率为70%。A 组和B 组牦牛的样品OD450nm均＜0.6，无抗体合格样本；C 组有1 头牦牛的样品OD450nm＞0.6，抗体合格率为10%，与E 组差异显著（P＜0.05）；D 组有4 头牦牛的样品OD450nm＞0.6，抗体合格率为40%，与E 组存在显著性差异（P＜0.05）。具体结果见表1 和图1。

3 讨论

牦牛养殖是四川省藏族地区农牧民的重要收入来源之一，而四川省牧区也是包虫病的重要流行区，包虫病流行严重影响了当地畜牧业发展和农牧民收入增长。加快推进牦牛包虫病免疫防控，建立健全畜间防控体制机制，是解决农牧民增收，加快乡村振兴的重要技术手段。

细粒棘球绦虫EG95 重组蛋白可以诱导机体产生特异性抗体，有效抵抗棘球蚴感染。以EG95 蛋白为基础研制的基因工程亚单位疫苗在多种动物及不同国家和地区的临床试验和田间试验中均表现了良好的预防效果[5-6]。Heath 等[7-8]进行牛（免疫剂量分别为50、250 和500 μg EG95 抗原）和牦牛（免疫剂量为50 μg EG95 抗原）免疫保护试验发现：在二次免疫（250 μg EG95 抗原）后，免疫保护率达90%，并能维持12 个月；在二次免疫12 个月后进行三免，保护率提高到99%。牦牛是生活在高寒高海拔地区的特殊畜种。阳爱国等[9]试验了包虫病基因工程EG95 疫苗（免疫剂量分别为250和500 μg EG95 抗原）对牦牛的免疫效果、安全性，并调查该疫苗在不同性别、不同年龄、不同海拔地区牦牛间存在的免疫差异性，结果发现各试验组牦牛在免疫抗体产生时间、群体阳性率等方面无显著差异（P＞0.05），且该疫苗适用于不同海拔地区牦牛使用，安全性高并可产生较高的抗体水平。

本研究试验了不同剂量（分别含有50、100、150、200、250 μg EG95 抗原）包虫病基因工程亚单位疫苗EG95 对牦牛的免疫效果，发现当免疫剂量为250 μg 时，抗体合格率显著高于其他剂量组，群体抗体阳性率和合格率均较为理想。因此，建议对适龄牦牛进行二次免疫，每次的免疫剂量为250 μg EG95 抗原，间隔28 d。