大白菜LACS 家族基因鉴定与表达分析

王荣花，王树彬，刘栓桃，张志刚，李巧云，王立华，赵智中

(山东省农业科学院蔬菜研究所/国家蔬菜改良中心山东分中心/山东省设施蔬菜生物学重点实验室/农业部黄淮地区蔬菜科学观测实验站(山东)，山东 济南 250100)

脂酰辅酶A 合成酶(fatty acyl－CoA synthetase，ACS)存在于内质网线粒体外膜上，根据碳链的长短被分为4 类:短链脂酰辅酶A 合成酶(C2～C4)、中链脂酰辅酶A 合成酶(C4～C12)、长链脂酰辅酶A 合成酶(C12～C20)及超长链脂酰辅酶A 合成酶(>C20)。 其中，长链脂酰辅酶A合成酶(LACS)广泛存在于各种生物中，在脂肪酸合成和分解代谢中发挥着重要作用［1］。 研究人员在拟南芥基因组中鉴定到9 个LACS 成员，分别为AtLACS1 ～ AtLACS9［2］，其中，AtLACS1、At-LACS2和AtLACS4基因在蜡质合成和角质合成途径中起着重要的作用［3－5］，且AtLACS1和AtLACS4在花粉壁形成中也具有一定功能［5］；AtLACS6和AtLACS7基因产物定位在过氧化体中，对脂肪酸β－氧化有加性效应，参与拟南芥中脂肪酸的降解［6］；转化AtLACS9可促进大豆的油脂合成［7］。在油菜中的研究表明，BnLACS2的转录增加了种子中参与糖酵解、脂肪酸和脂质合成基因的表达，是影响甘蓝型油菜种子产油的一个重要因素［8］；BnLACS9参与了叶绿素的生物合成［9］。

大白菜(Brassica rapaL. ssp.pekinensis)属于十字花科芸薹属，是我国重要的十字花科蔬菜，随着生活水平的提高，人们对其品质的要求不断提高。LACS基因家族在植物脂质的合成和分解代谢中起着重要作用，研究其家族成员特性对提高大白菜品质具有一定意义。LACS家族成员已在拟南芥［10］、小麦［11］、棉花［12］、大豆［13］、油菜［14］等物种中被鉴定出，但基因序列在不同物种间存在较大差异，而蛋白序列相对保守［15］。 目前大白菜LACS家族基因的研究尚未见报道。 因此，本研究以大白菜Chiifu 基因组数据作参考［16］，通过生物信息学方法鉴定大白菜LACS 家族成员，并对其进行系统发育树构建、染色体定位、基因结构及表达模式分析，为深入研究大白菜LACS家族基因奠定基础。

1 材料与方法

1.1 大白菜LACS 家族基因的鉴定

从TAIR 数据库(http:/ /www. arabidopsis.org/)下载了拟南芥LACS 家族蛋白序列共计9 条(AtLACS1～AtLACS9)［15］。 在BRAD 数据库(http:/ /brassicadb. org/brad/)［16，17］下 载 大 白 菜(V3.0版本)和甘蓝(Braol JZS＿V2.0 版本)全基因组蛋白序列文件和gff3 文件构建本地BLASTP 数据库，将AtLACS 家族的蛋白序列通过本地BLASTP 比对出大白菜(Br)LACS 和甘蓝(Bo)LACS 的家族成员。BrLACS和BoLACS基因的命名根据其与AtLACS1～AtLACS9序列的同源性及共线性关系进行，部分同源基因通过添加小写英文字母后缀(a、b、c 等)进行区分。

1.2 大白菜LACS 蛋白特征预测、系统发育、进化树分析及保守基序分析

利用在线ProtParam 工具(https:/ /web.expasy.org/protparam/)对获得的BrLACS 蛋白质序列分子量、理论等电点和亲水性平均系数进行分析。 利用Gene Structure Display Server(GSDS 2.0，http:/ /gsds.gao－lab.org/)根据每个BrLACS基因组序列和相应的CDS 序列绘制基因结构图［18］。利用MEGA 7.0 对BrLACS、AtLACS 和BoLACS 蛋白质序列绘制系统进化树，采用邻接法(Neighborjoining)，设置Bootstrap 值为1 000，其他参数保持默认值［19］。 使用模体分析工具MEME(http:/ /meme－suite.org/)对BrLACS 蛋白进行保守基序分析，其中最适基序宽度设置为6～50，最大基序设置为10，其他为默认参数。

1.3 大白菜LACS 基因的染色体定位及共线性分析

根据BrLACS基因在染色体上的物理位置，使用MapChart 2.30［20］对BrLACS基因进行染色体定位。 利用BRAD(http:/ /brassicadb.org/brad/searchSyntenytPCK.php)数据库分析大白菜、甘蓝和拟南芥之间的亲缘关系，利用TBtools［21］绘制共线性图。

1.4 大白菜LACS 基因在不同器官/组织以及不同材料中的表达模式分析

2 结果与分析

为了分析大白菜不同器官/组织中BrLACS基因的表达水平，在NCBI 的GEO 数据库下载大白菜不同器官/组织(愈伤组织、根、茎、叶、花和角果) 转 录 组 数 据(登 录 号: GSE43245)， 以BrLACS基因的log2(FPKM＋1)(fragments per kilobase per million mapped reads)值来表示BrLACSs在不同器官/组织中的表达水平，并绘制热图。

前期构建了大白菜花茎有蜡粉组(RHL065＿1＿T1、RHL065＿1＿T2、RHL065＿1＿T3)与无蜡粉组(RHL065＿2＿T1、RHL065＿2＿T2、RHL065＿2＿T3)两组cDNA 文库，并对文库质量检测后应用Illumina HiSeq 平台进行测序［22］。 根据RNA－Seq 数据中获取的每个BrLACS基因的FPKM 值来绘制柱形图。

2.1 大白菜LACS 家族基因的鉴定、系统发育和蛋白特征分析

通过对全基因组蛋白质数据库的鉴定和结构域验证，在大白菜和甘蓝基因组中分别鉴定到13个BrLACS 和13 个BoLACS 蛋白(图1，表1)。 从大白菜、甘蓝和拟南芥LACS 蛋白序列的无根系统进化树可见，这些LACS 蛋白成员根据亲缘关系的远近被分为4 组，Group A、B、C、D 分别包含7、14、8、6 个LACS 成员(图1)。 其中，Group A 包括BrLACS1a、BrLACS1b 和BrLACS1c，Group B 包括BrLACS2、 BrLACS3、 BrLACS4、 BrLACS5a 和BrLACS5b，Group C 包括BrLACS6a、BrLACS6b 和BrLACS7，Group D 包括BrLACS8 和BrLACS9。

图1 大白菜(Br)、甘蓝(Bo)、拟南芥(At)LACS 蛋白系统进化树分析

通过在线ProtParam 工具预测了BrLACS 蛋白的物理和化学特征，结果(表1)显示，BrLACS蛋白长度为199 ～ 1 072 aa，分子量为23.10～121.10 kDa，理论等电点为5.66～9.21，总平均亲水性均为负值(－0.398～－0.049)，为亲水性蛋白。

表1 大白菜和拟南芥相对应LACS 家族成员信息

2.2 大白菜LACS 基因的染色体分布和共线性分析

从表1 可以看出，BrLACS家族基因的13 个成员分布在3 个亚基因组上，其中亚基因组LF 有6 个BrLACS基因，MF1 有1 个BrLACS基因，MF2有6 个BrLACS基因。 与AtLACS基因相比，BrLACS基因在芸薹族特异的全基因组三倍化事件后均被保留。 总共有6 个BrLACS基因(BrLACS2、BrLACS3、BrLACS4、BrLACS7、BrLACS8和BrLACS9)保留了单拷贝，2 个BrLACS基因(BrLACS5和BrLACS6) 保 留 了 双 拷 贝， 1 个BrLACS基因(BrLACS1)保留了三拷贝。 13 个BrLACS基因中，BrLACS1c只锚定到Scaffold0640上，未能锚定到大白菜的任何染色体上，其余12个则被定位在7 条染色体上，其中，BrLACS4位于染色体A01 上，BrLACS5b位于染色体A02 上，BrLACS6b和BrLACS8位 于 染 色 体 A03 上，BrLACS1a、BrLACS1b、BrLACS2和BrLACS6a位于染色体A05 上，BrLACS7位于染色体A06 上，BrLACS9位 于 染 色 体 A07 上，BrLACS3和BrLACS5a位于染色体A09 上(图2)。

图2 大白菜LACS 基因在7 条染色体上的定位分布

将鉴定到的直系和旁系同源LACS基因用于分析BrLACS、BoLACS和AtLACS基因间的共线性，结果鉴定到大白菜之间3 对旁系同源基因、大白菜与拟南芥之间12 对直系同源基因以及大白菜与甘蓝之间20 对直系同源基因(图3)。

图3 大白菜(Br)、拟南芥(At)和甘蓝(Bo)LACS 基因的共线性关系

2.3 大白菜LACS 基因结构分析

根据BrLACS家族成员的CDS 和DNA 序列，绘制BrLACS基因结构图，结果(图4) 显示，BrLACS家族成员之间的外显子数量差异较大(4～32 个)。 其中BrLACS1a含有4 个外显子，BrLACS9含有10 个外显子，BrLACS8含有11 个外显子，BrLACS1b含有17 个外显子，BrLACS3、BrLACS4和BrLACS5a含有18 个外显子，BrLACS2含有19 个外显子，BrLACS5b含有20 个外显子，BrLACS6a、BrLACS6b和BrLACS7含有23 个外显子，BrLACS1c基因均含有32 个外显子。

图4 大白菜LACS 家族基因外显子－内含子结构分析

2.4 大白菜LACS 蛋白保守结构域分析

利用MEME 在线分析工具对BrLACS 家族蛋白保守结构域进行分析，共获得10 个保守基序，分别命名为Motif1～Motif10。 13 个BrLACS 家族成员中，有9 个成员均含有Motif1～Motif10 保守基序，而BrLACS1a 中只有motif 1 和motif 3，BrLACS7 中没有motif 9，BrLACS8 和BrLACS9 中没有motif 8(图5)。

图5 大白菜LACS 家族成员蛋白保守结构域分析

2.5 大白菜LACS 家族基因表达分析

2.5.1 组织特异性表达分析 通过分析BrLACS家族基因在大白菜不同器官中的表达，结果(图6)显示，大多数BrLACS在大白菜花中高表达，其次是在角果、叶、根和茎中；BrLACS4和BrLACS8在各器官/组织中的整体表达量最高，BrLACS5a和BrLACS5b在各器官/组织中的整体表达量最低。 花中表达量较高的是BrLACS8、BrLACS6a和BrLACS4，角果中表达较高的是BrLACS4、BrLACS9和BrLACS8，叶中表达量较高的是BrLACS4、BrLACS9和BrLACS1b；各器官/组织中均未找到BrLACS1a基因的表达。

2.5.2 在有蜡粉和无蜡粉大白菜中的表达分析如图7 所示，总体而言，BrLACS1b、BrLACS2、BrLACS4、BrLACS5a、BrLACS5b、BrLACS6a、BrLACS8和BrLACS9基因在有蜡粉大白菜中的表达量显著高 于 无 蜡 粉 大 白 菜；BrLACS3、BrLACS6b和BrLACS7基因在有蜡粉大白菜中的表达量显著低于无蜡粉大白菜；BrLACS1c在两组大白菜中的表达 量 都 很 高， 但 差 异 不 显 著。BrLACS3、BrLACS5a、BrLACS5b和BrLACS7整体表达水平都很低。

图7 BrLACS 基因在有蜡粉和无蜡粉大白菜材料中的表达分析

图6 大白菜LACS 基因在不同组织/器官中的表达分析

3 讨论

植物表皮蜡粉主要由超长链脂肪酸及其衍生物组成，在植物抗干旱、抵御病害等生物与非生物胁迫方面起着重要作用［22，23］。 同时对于大白菜等叶用蔬菜作物特别是白菜薹品种，蜡粉还是重要的商品性状。 LACS 是脂肪酸代谢途径中的关键酶，催化长链酰基辅酶A 的合成，能够在多种生物过程中发挥作用［15，24－26］。

随着基因组学的快速发展，越来越多的LACS家族基因成员被分离鉴定［1，15］，拟南芥中发现了9 个LACS基因［10］，小麦中发现了148 个LACS基因［11］，陆地棉中发现了21 个LACS基因［12］，油菜中发现了34 个LACS基因［14］。 本研究发现大白菜和甘蓝中分别有13 个BrLACSs和13 个BoLACSs基因，均多于AtLACSs的数量，但不是理论上的三倍数量关系，这可能是芸薹属特有的全基因组三倍化事件以及偏性基因丢失事件造成的［16，27］。对拟南芥、大白菜和甘蓝的共线性分析结果显示，大白菜与拟南芥发生分化之后，BrLACS5和BrLACS6保留了双拷贝，BrLACS1保留了三拷贝，其余BrLACSs均保留了单拷贝。

本研究结果显示，大白菜LACS基因成员间在外显子－内含子结构上具有较大差异，而外显子－内含子结构差异在基因家族的进化中起着重要作 用［28］。 此 外， 旁 系 同 源 基 因BrLACS1a、BrLACS1b和BrLACS1c之间发生了明显可变剪切和内 含 子 插 入， 导 致BrLACS1a、BrLACS1b与BrLACS1c基因之间出现了功能的多样性，BrLACS1b与BrLACS1c在不同器官/组织以及有蜡粉和无蜡粉大白菜中表达水平差异显著，而BrLACS1a基因在以上分析中均没有表达量。

拟南芥LACS 家族的9 个成员中，已发现LACS1、LACS2和LACS4基因在表皮蜡质合成和角质合成途径中起着重要的作用［3－5］。 研究发现，拟南芥lacs1突变体表现出蜡质含量减少，lacs2突变体也表现出角质减少，而lacs1和lacs2的拟南芥双突变体相对于各自单变体，蜡质的总量有所降低且表皮渗透性增强［3，4］；拟南芥lacs4突变体中蜡质含量减少，占野生型的73%，lacs1突变体中蜡质含量占野生型的35%，lacs1和lacs4双突变体蜡质含量占野生型的23%［5］。 拟南芥的外表皮蜡质主要以柱状晶体形式存在于茎、荚果和柱头上，以非晶体形式存在于叶片上［29－31］。本研究发现，大部分BrLACS家族成员在大白菜花中高表达，而在愈伤组织中表达量很低；BrLACS4在各器官/组织中整体表达量最高，BrLACS8在各器官/组织中整体表达量高且在有蜡粉大白菜中的表达量显著高于无蜡粉大白菜。本研究结果可为后续进一步开展BrLACS8基因在控制大白菜蜡质性状中的具体功能研究奠定基础。

4 结论

本研究在大白菜全基因组中共筛选出13 个BrLACS基因家族成员，可分为4 组，不均匀地分布在7 条染色体和1 个Scaffold 上。BrLACS4、BrLACS8在大白菜各器官/组织中表达量高且在有蜡粉大白菜中的表达量显著高于无蜡粉大白菜，其可能在控制大白菜蜡质性状中发挥重要的作用。